Microscopía

La microscopía de campo claro es la más sencilla de todas las técnicas de microscopía óptica. La iluminación de la muestra se realiza mediante luz blanca transmitida, es decir, se ilumina desde abajo y se observa desde arriba. Entre sus limitaciones se incluyen el bajo contraste de la mayoría de las muestras biológicas y la baja resolución aparente debido al desenfoque del material fuera de foco. La sencillez de la técnica y la mínima preparación de la muestra requerida constituyen ventajas significativas.

El uso de iluminación oblicua (lateral) confiere a la imagen una apariencia tridimensional y permite resaltar detalles que de otro modo serían invisibles. Una técnica más reciente basada en este método es el contraste de modulación de Hoffmann , un sistema presente en microscopios invertidos para el cultivo celular. La iluminación oblicua mejora el contraste incluso en muestras transparentes; sin embargo, debido a que la luz incide fuera del eje, la posición del objeto parecerá desplazarse al cambiar el enfoque. Esta limitación imposibilita técnicas como el seccionamiento óptico o la medición precisa en el eje z.

La microscopía de campo oscuro es una técnica para mejorar el contraste de muestras transparentes sin teñir. ^{[ 18 ]} La iluminación de campo oscuro utiliza una fuente de luz cuidadosamente alineada para minimizar la cantidad de luz transmitida directamente (no dispersada) que entra en el plano de la imagen, recogiendo solo la luz dispersada por la muestra. El campo oscuro puede mejorar drásticamente el contraste de la imagen, especialmente de objetos transparentes, con una mínima preparación del equipo y de la muestra. Sin embargo, la técnica presenta una baja intensidad de luz en la imagen final de muchas muestras biológicas y sigue viéndose afectada por una baja resolución aparente.

La iluminación de Rheinberg es una variante de la iluminación de campo oscuro en la que se insertan filtros de color transparentes justo antes del condensador , de modo que los rayos de luz a gran apertura tienen un color diferente al de los rayos a baja apertura (es decir, el fondo de la muestra puede ser azul mientras que el objeto aparece rojo autoluminiscente). Son posibles otras combinaciones de colores, pero su efectividad es bastante variable. ^{[ 19 ]}

La tinción por dispersión es una técnica óptica que produce una imagen coloreada de un objeto incoloro. Se trata de una técnica de tinción óptica que no requiere colorantes ni tintes para generar el efecto de color. Existen cinco configuraciones de microscopio diferentes que se utilizan en la técnica de tinción por dispersión: campo claro (línea de Becke), campo oblicuo, campo oscuro, contraste de fase y tinción por dispersión con diafragma del objetivo.

En microscopía electrónica : Imagen de contraste de fase

Técnicas más sofisticadas mostrarán diferencias proporcionales en la densidad óptica. El contraste de fase es una técnica ampliamente utilizada que muestra las diferencias en el índice de refracción como diferencias de contraste. Fue desarrollada por el físico neerlandés Frits Zernike en la década de 1930 (por lo que recibió el Premio Nobel en 1953). El núcleo de una célula, por ejemplo, aparecerá oscuro sobre el citoplasma circundante. El contraste es excelente; sin embargo, no es adecuado para objetos gruesos. Con frecuencia, se forma un halo incluso alrededor de objetos pequeños, lo que oculta los detalles. El sistema consta de un anillo circular en el condensador, que produce un cono de luz. Este cono se superpone a un anillo de tamaño similar dentro del objetivo de fase. Cada objetivo tiene un anillo de diferente tamaño, por lo que se debe elegir una configuración de condensador distinta para cada objetivo. El anillo del objetivo tiene propiedades ópticas especiales: en primer lugar, reduce la intensidad de la luz directa, pero, lo que es más importante, crea una diferencia de fase artificial de aproximadamente un cuarto de longitud de onda. Al modificarse las propiedades físicas de esta luz directa, se produce una interferencia con la luz difractada, lo que da como resultado una imagen de contraste de fase. Una desventaja de la microscopía de contraste de fase es la formación de halos (anillos de luz).

El uso del contraste de interferencia es superior y mucho más costoso . Las diferencias en la densidad óptica se manifiestan como diferencias de relieve. Según Georges Nomarski , en el sistema de contraste de interferencia diferencial más utilizado, un núcleo dentro de una célula aparece como un glóbulo . Sin embargo, cabe recordar que se trata de un efecto óptico y que el relieve no necesariamente se asemeja a la forma real. El contraste es excelente y la apertura del condensador puede utilizarse completamente abierta, reduciendo así la profundidad de campo y maximizando la resolución.

El sistema consta de un prisma especial ( prisma de Nomarski o prisma de Wollaston ) en el condensador que divide la luz en un haz ordinario y otro extraordinario. La diferencia espacial entre ambos haces es mínima (inferior a la resolución máxima del objetivo). Tras atravesar la muestra, los haces se vuelven a unir mediante un prisma similar en el objetivo.

En una muestra homogénea, no existe diferencia entre los dos haces y no se genera contraste. Sin embargo, cerca de un límite de refracción (por ejemplo, un núcleo dentro del citoplasma), la diferencia entre el haz ordinario y el extraordinario generará un relieve en la imagen. El contraste de interferencia diferencial requiere una fuente de luz polarizada para funcionar; se deben instalar dos filtros polarizadores en la trayectoria de la luz: uno debajo del condensador (el polarizador) y el otro encima del objetivo (el analizador).

Nota: En los casos en que el diseño óptico de un microscopio produce una separación lateral apreciable de los dos haces, tenemos el caso de la microscopía de interferencia clásica , que no produce imágenes en relieve, pero que, no obstante, puede utilizarse para la determinación cuantitativa de los espesores de masa de objetos microscópicos.

Otra técnica que utiliza la interferencia es la microscopía de reflexión por interferencia (también conocida como contraste de interferencia reflejada o RIC). Esta técnica se basa en la adhesión celular al portaobjetos para producir una señal de interferencia. Si no hay células adheridas al vidrio, no habrá interferencia.

La microscopía de reflexión por interferencia se puede obtener utilizando los mismos elementos que la DIC, pero sin los prismas. Además, la luz que se detecta se refleja y no se transmite, como ocurre cuando se emplea la DIC.

Cuando ciertos compuestos se iluminan con luz de alta energía, emiten luz de menor frecuencia. Este efecto se conoce como fluorescencia . A menudo, las muestras muestran su imagen de autofluorescencia característica , que depende de su composición química.

Este método es de vital importancia en las ciencias biológicas modernas, ya que puede ser extremadamente sensible, permitiendo la detección de moléculas individuales. Se pueden utilizar muchos colorantes fluorescentes para teñir estructuras o compuestos químicos. Un método eficaz es la combinación de anticuerpos acoplados a un fluoróforo, como en la inmunotinción . Ejemplos de fluoróforos de uso común son la fluoresceína o la rodamina .

Los anticuerpos pueden diseñarse a medida para un compuesto químico específico. Por ejemplo, una estrategia común consiste en la producción artificial de proteínas, a partir del código genético (ADN). Estas proteínas se utilizan para inmunizar conejos, generando anticuerpos que se unen a la proteína. Posteriormente, los anticuerpos se unen químicamente a un fluoróforo y se utilizan para rastrear las proteínas en las células estudiadas.

Se han desarrollado proteínas fluorescentes de alta eficiencia, como la proteína verde fluorescente (GFP), mediante la técnica de biología molecular de fusión génica , un proceso que vincula la expresión del compuesto fluorescente con la de la proteína diana. Esta proteína fluorescente combinada, en general, no es tóxica para el organismo y rara vez interfiere con la función de la proteína en estudio. Las células u organismos modificados genéticamente expresan directamente las proteínas marcadas con fluorescencia, lo que permite estudiar la función de la proteína original in vivo .

El crecimiento de cristales de proteína da como resultado cristales tanto de proteína como de sal. Ambos son incoloros y microscópicos. La recuperación de los cristales de proteína requiere imágenes, las cuales pueden obtenerse mediante la fluorescencia intrínseca de la proteína o mediante microscopía de transmisión. Ambos métodos requieren un microscopio ultravioleta, ya que las proteínas absorben luz a 280  nm. La proteína también presenta fluorescencia a aproximadamente 353  nm cuando se excita con  luz de 280 nm. ^{[ 20 ]}

Dado que la emisión de fluorescencia difiere en longitud de onda (color) de la luz de excitación, una imagen de fluorescencia ideal muestra únicamente la estructura de interés marcada con el colorante fluorescente. Esta alta especificidad propició el uso generalizado de la microscopía de fluorescencia en la investigación biomédica. Se pueden utilizar diferentes colorantes fluorescentes para teñir distintas estructuras biológicas, las cuales pueden detectarse simultáneamente, manteniendo la especificidad gracias al color individual de cada colorante.

Para impedir que la luz de excitación llegue al observador o al detector, se necesitan conjuntos de filtros de alta calidad. Estos suelen constar de un filtro de excitación que selecciona el rango de longitudes de onda de excitación , un espejo dicroico y un filtro de emisión que bloquea la luz de excitación. La mayoría de los microscopios de fluorescencia funcionan en modo de epi-iluminación (iluminación y detección desde un lado de la muestra) para reducir aún más la cantidad de luz de excitación que llega al detector.

Véase también: microscopio de fluorescencia de reflexión interna total Neurociencia

La microscopía confocal de barrido láser utiliza un haz láser enfocado (por ejemplo, de 488  nm) que se desplaza sobre la muestra para excitar la fluorescencia punto por punto. La luz emitida se dirige a través de un orificio para evitar que la luz desenfocada llegue al detector, generalmente un tubo fotomultiplicador . La imagen se construye en un ordenador, representando gráficamente las intensidades de fluorescencia medidas según la posición del láser de excitación. En comparación con la iluminación completa de la muestra, la microscopía confocal ofrece una resolución lateral ligeramente superior y mejora significativamente el seccionamiento óptico (resolución axial). Por lo tanto, la microscopía confocal se utiliza habitualmente cuando la estructura tridimensional es importante.

Un subtipo de microscopios confocales son los microscopios de disco giratorio , capaces de escanear múltiples puntos simultáneamente en la muestra. Un disco con orificios de diafragma rechaza la luz desenfocada. El detector de luz en un microscopio de disco giratorio es una cámara digital, generalmente EM-CCD o sCMOS .

Un microscopio de dos fotones también es un microscopio de escaneo láser, pero en lugar de luz láser UV, azul o verde, se utiliza un láser infrarrojo pulsado para la excitación. Solo en el pequeño foco del láser la intensidad es lo suficientemente alta como para generar fluorescencia por excitación de dos fotones , lo que significa que no se genera fluorescencia fuera de foco y no es necesario un orificio para limpiar la imagen. ^{[ 21 ]} Esto permite obtener imágenes en profundidad en tejido dispersor, donde un microscopio confocal no podría recolectar fotones de manera eficiente. ^{[ 22 ]} Los microscopios de dos fotones con detección de campo amplio se utilizan frecuentemente para imágenes funcionales, por ejemplo, imágenes de calcio , en tejido cerebral. ^{[ 23 ]} Varias empresas los comercializan como microscopios multifotónicos , aunque las ventajas de usar excitación de 3 fotones en lugar de 2 fotones son marginales.

Utilizando un plano de luz formado al enfocar la luz a través de una lente cilíndrica en un ángulo estrecho o al escanear una línea de luz en un plano perpendicular al eje del objetivo, se pueden obtener secciones ópticas de alta resolución. ^{[ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]} La iluminación de un solo plano, o iluminación de lámina de luz, también se logra utilizando técnicas de conformación de haz que incorporan expansores de haz de prismas múltiples . ^{[ 27 ] [ 28 ]} Las imágenes son capturadas por CCD. Estas variantes permiten una captura de imágenes muy rápida y con una alta relación señal/ruido.

La microscopía multifotónica de campo amplio ^{[ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]} se refiere a una técnica de imagen óptica no lineal en la que se ilumina y se obtiene una imagen de una gran área del objeto sin necesidad de escaneo. Se requieren altas intensidades para inducir procesos ópticos no lineales como la fluorescencia de dos fotones o la generación de segundo armónico . En los microscopios multifotónicos de escaneo, las altas intensidades se logran enfocando la luz con precisión, y la imagen se obtiene mediante el escaneo del haz. En la microscopía multifotónica de campo amplio, las altas intensidades se logran mejor utilizando una fuente láser pulsada ópticamente amplificada para obtener un gran campo de visión (~100  μm). ^{[ 29 ] [ 30 ] [ 31 ]} En este caso, la imagen se obtiene como un solo fotograma con una cámara CCD sin necesidad de escaneo, lo que hace que la técnica sea particularmente útil para visualizar procesos dinámicos simultáneamente en todo el objeto de interés. Con la microscopía multifotónica de campo amplio, la velocidad de fotogramas puede aumentarse hasta 1000 veces en comparación con la microscopía de escaneo multifotónica . ^{[ 30 ]} Sin embargo, en el tejido dispersor, la calidad de la imagen se degrada rápidamente con el aumento de la profundidad.

La microscopía de fluorescencia es una técnica potente para visualizar estructuras marcadas específicamente en entornos complejos y para obtener información tridimensional de estructuras biológicas. Sin embargo, esta información se ve afectada por el hecho de que, al ser iluminadas, todas las estructuras marcadas con fluorescencia emiten luz, independientemente de si están enfocadas o no. Por lo tanto, la imagen de una estructura determinada siempre aparece borrosa debido a la luz proveniente de estructuras desenfocadas. Este fenómeno provoca una pérdida de contraste, especialmente al utilizar objetivos con un alto poder de resolución, como los objetivos de inmersión en aceite con una alta apertura numérica.

Sin embargo, el desenfoque no se debe a procesos aleatorios, como la dispersión de la luz, sino que puede definirse con precisión mediante las propiedades ópticas de la formación de la imagen en el sistema de imagen del microscopio. Si consideramos una pequeña fuente de luz fluorescente (esencialmente un punto brillante), la luz que emana de este punto se dispersa más lejos de nuestra perspectiva a medida que el punto se desenfoca. En condiciones ideales, esto produce una forma de "reloj de arena" para esta fuente puntual en la tercera dimensión (axial). Esta forma se denomina función de dispersión puntual (PSF) del sistema de imagen del microscopio. Dado que cualquier imagen de fluorescencia se compone de un gran número de estas pequeñas fuentes de luz fluorescente, se dice que la imagen está "convolucionada por la función de dispersión puntual". La PSF modelada matemáticamente de un sistema de imagen pulsado láser de terahercios se muestra a la derecha.

La salida de un sistema de imágenes se puede describir mediante la siguiente ecuación:

${\displaystyle s(x,y)=PSF(x,y)*o(x,y)+n}$

Donde n es el ruido aditivo. ^{[ 34 ]} Conociendo esta función de dispersión de punto ^{[ 35 ]} significa que es posible revertir este proceso hasta cierto punto mediante métodos basados ​​en computadora comúnmente conocidos como microscopía de deconvolución . ^{[ 36 ]} Hay varios algoritmos disponibles para la deconvolución 2D o 3D. Se pueden clasificar a grandes rasgos en métodos no restauradores y restauradores . Mientras que los métodos no restauradores pueden mejorar el contraste eliminando la luz desenfocada de los planos focales, solo los métodos restauradores pueden reasignar la luz a su lugar de origen correcto. Procesar imágenes fluorescentes de esta manera puede ser una ventaja sobre la adquisición directa de imágenes sin luz desenfocada, como las imágenes de la microscopía confocal , porque las señales de luz que de otro modo se eliminarían se convierten en información útil. Para la deconvolución 3D, normalmente se proporciona una serie de imágenes tomadas de diferentes planos focales (llamada pila Z) más el conocimiento de la PSF, que se puede derivar experimental o teóricamente a partir del conocimiento de todos los parámetros contribuyentes del microscopio.