Microscopía de fuerza atómica

El microscopio de fuerza atómica (AFM) tiene tres capacidades principales: medición de fuerza, obtención de imágenes topográficas y manipulación.

En la medición de fuerzas, los microscopios de fuerza atómica (AFM) permiten medir las fuerzas entre la sonda y la muestra en función de su separación mutua. Esto se puede aplicar para realizar espectroscopia de fuerza y ​​medir las propiedades mecánicas de la muestra, como el módulo de Young , una medida de su rigidez.

Para la obtención de imágenes, la reacción de la sonda a las fuerzas que ejerce la muestra sobre ella permite generar una imagen tridimensional (topografía) de la superficie de la muestra con alta resolución. Esto se logra mediante el escaneo raster de la posición de la muestra con respecto a la punta y el registro de la altura de la sonda que corresponde a una interacción constante entre la sonda y la muestra. La topografía de la superficie se suele representar mediante un gráfico de pseudocolor .

Aunque la publicación inicial sobre microscopía de fuerza atómica de Binnig, Quate y Gerber en 1986 especuló sobre la posibilidad de alcanzar la resolución atómica, fue necesario superar profundos desafíos experimentales antes de que Ohnesorge y Binnig demostraran en 1993 la resolución atómica de defectos y bordes de escalones en condiciones ambientales (líquidas). ^{[ 2 ]} La verdadera resolución atómica de la superficie de silicio 7×7 tuvo que esperar un poco más antes de que la demostrara Giessibl. ^{[ 3 ]} La resolución subatómica (es decir, la capacidad de resolver detalles estructurales dentro de la densidad electrónica de un solo átomo) también se ha logrado mediante AFM.

En la manipulación, las fuerzas entre la punta y la muestra también pueden utilizarse para modificar las propiedades de esta última de forma controlada. Algunos ejemplos son la manipulación atómica, la litografía por sonda de barrido y la estimulación localizada de células.

Simultáneamente con la adquisición de imágenes topográficas, se pueden medir localmente otras propiedades de la muestra y visualizarlas como una imagen, a menudo con una resolución igualmente alta. Ejemplos de estas propiedades son las propiedades mecánicas, como la rigidez o la fuerza de adhesión, y las propiedades eléctricas, como la conductividad o el potencial superficial. ^{[ 4 ]} De hecho, la mayoría de las técnicas de SPM son extensiones de AFM que utilizan esta modalidad. ^{[ 5 ]}

La principal diferencia entre la microscopía de fuerza atómica y otras tecnologías similares, como la microscopía óptica y la electrónica, radica en que la AFM no utiliza lentes ni irradiación con haz. Por lo tanto, no presenta limitaciones en la resolución espacial debidas a la difracción y la aberración, y no requiere la preparación de un espacio para guiar el haz (mediante la creación de vacío) ni la tinción de la muestra.

Existen varios tipos de microscopía de barrido, incluyendo SPM (que incluye AFM, microscopía de efecto túnel (STM) y microscopía óptica de barrido de campo cercano (SNOM/NSOM), microscopía STED y microscopía electrónica de barrido y AFM electroquímica , EC-AFM). Aunque SNOM y STED utilizan luz visible , infrarroja o incluso de terahercios para iluminar la muestra, su resolución no está limitada por el límite de difracción.

La figura 3 muestra un AFM, que normalmente consta de las siguientes características. ^{[ 6 ]} Los números entre paréntesis corresponden a las características numeradas en la figura 3. Las direcciones de las coordenadas están definidas por el sistema de coordenadas (0).

La pequeña viga en voladizo con forma de resorte (1) se apoya en el soporte (2). Opcionalmente, un elemento piezoeléctrico (generalmente de material cerámico) (3) hace oscilar la viga (1). La punta afilada (4) está fijada al extremo libre de la viga (1). El detector (5) registra la deflexión y el movimiento de la viga (1). La muestra (6) está montada en la platina de muestras (8). Un actuador xyz (7) permite desplazar la muestra (6) y la platina de muestras (8) en las direcciones x, y y z con respecto al ápice de la punta (4). Aunque la figura 3 muestra el actuador acoplado a la muestra, también puede acoplarse a la punta, o bien se pueden acoplar actuadores independientes a ambos, ya que lo que se necesita controlar es el desplazamiento relativo de la muestra y la punta. Los controladores y el trazador no se muestran en la figura 3.

Según la configuración descrita anteriormente, la interacción entre la punta y la muestra, que puede ser un fenómeno a escala atómica, se transforma en cambios en el movimiento del voladizo, que es un fenómeno a escala macroscópica. Se pueden utilizar varios aspectos del movimiento del voladizo para cuantificar la interacción entre la punta y la muestra; los más comunes son el valor de la deflexión, la amplitud de una oscilación impuesta del voladizo o el cambio en la frecuencia de resonancia del voladizo (véase la sección Modos de imagen).

Formación de imágenes

Esta sección se aplica específicamente a la obtención de imágenes en el  modo de contacto . Para otros modos de obtención de imágenes, el proceso es similar, salvo que la "deflexión" debe sustituirse por la variable de retroalimentación correspondiente.

Al utilizar el microscopio de fuerza atómica (AFM) para obtener imágenes de una muestra, la punta se pone en contacto con la muestra y esta se escanea mediante un barrido raster a lo largo de una cuadrícula x-y. Generalmente, se emplea un bucle de retroalimentación electrónico para mantener constante la fuerza entre la sonda y la muestra durante el escaneo. Este bucle recibe como entrada la deflexión del voladizo y su salida controla la distancia a lo largo del eje z entre el soporte de la sonda (2 en la figura 3) y el soporte de la muestra (8 en la figura 3). Mientras la punta permanezca en contacto con la muestra y esta se escanee en el plano x-y, las variaciones de altura en la muestra modificarán la deflexión del voladizo. El bucle de retroalimentación ajusta entonces la altura del soporte de la sonda para que la deflexión vuelva a un valor definido por el usuario (el punto de ajuste). Un bucle de retroalimentación correctamente ajustado ajusta continuamente la separación entre el soporte y la muestra durante el movimiento de escaneo, de modo que la deflexión se mantenga aproximadamente constante. En esta situación, la salida del bucle de retroalimentación coincide con la topografía de la superficie de la muestra con un pequeño margen de error.

Históricamente, se ha utilizado un método de operación diferente, en el que la distancia entre la muestra y la sonda se mantiene constante y no se controla mediante retroalimentación ( servomecanismo ). En este modo, generalmente denominado "modo de altura constante", la deflexión del voladizo se registra en función de la posición x-y de la muestra. Mientras la punta esté en contacto con la muestra, la deflexión corresponde a la topografía de la superficie. Este método se utiliza ahora con menos frecuencia porque las fuerzas entre la punta y la muestra no se controlan, lo que puede generar fuerzas lo suficientemente altas como para dañar la punta o la muestra. Sin embargo, es práctica común registrar la deflexión incluso al escanear en modo de fuerza constante, con retroalimentación. Esto revela el pequeño error de seguimiento de la retroalimentación y, en ocasiones, puede revelar características que la retroalimentación no pudo corregir.

Las señales del microscopio de fuerza atómica (AFM), como la altura de la muestra o la deflexión del voladizo, se registran en un ordenador durante el escaneo x-y. Estas señales se representan en una imagen de pseudocolor , donde cada píxel representa una posición x-y en la muestra y el color representa la señal registrada.

El AFM fue inventado por científicos de IBM en 1985. ^{[ 7 ]} El precursor del AFM, el microscopio de efecto túnel (STM), fue desarrollado por Gerd Binnig y Heinrich Rohrer a principios de la década de 1980 en IBM Research – Zurich , un desarrollo que les valió el Premio Nobel de Física de 1986. Binnig inventó ^{[ 6 ]} el microscopio de fuerza atómica y la primera implementación experimental fue realizada por Binnig, Quate y Gerber en 1986. ^{[ 8 ]}

El primer microscopio de fuerza atómica disponible comercialmente se presentó en 1989. El AFM es una de las herramientas más importantes para la obtención de imágenes, la medición y la manipulación de la materia a nanoescala .

El microscopio de fuerza atómica (AFM) se ha aplicado a problemas en una amplia gama de disciplinas de las ciencias naturales, incluyendo la física del estado sólido , la ciencia y tecnología de semiconductores , la ingeniería molecular , la química y física de polímeros , la química de superficies , la biología molecular , la biología celular y la medicina .

Las aplicaciones en el campo de la física del estado sólido incluyen (a) la identificación de átomos en una superficie, (b) la evaluación de las interacciones entre un átomo específico y sus átomos vecinos, y (c) el estudio de los cambios en las propiedades físicas que surgen de cambios en una disposición atómica a través de la manipulación atómica.

En biología molecular, la microscopía de fuerza atómica (AFM) se puede utilizar para estudiar la estructura y las propiedades mecánicas de complejos y ensamblajes de proteínas. Por ejemplo, se ha utilizado para obtener imágenes de microtúbulos y medir su rigidez.

En biología celular, la microscopía de fuerza atómica (AFM) se puede utilizar para intentar distinguir células cancerosas de células normales según su dureza, y para evaluar las interacciones entre una célula específica y sus células vecinas en un sistema de cultivo competitivo. La AFM también se puede utilizar para indentar las células y estudiar cómo regulan la rigidez o la forma de la membrana o pared celular.

En algunas variantes, también se pueden escanear potenciales eléctricos utilizando voladizos conductores. En versiones más avanzadas, se pueden hacer pasar corrientes a través de la punta para sondear la conductividad eléctrica o el transporte de la superficie subyacente, pero esta es una tarea compleja con pocos grupos de investigación que informan datos consistentes (a partir de 2004). ^{[ 9 ]} Las técnicas de AFM, como la microscopía de fuerza atómica conductiva (C-AFM) y la microscopía de fuerza de sonda Kelvin (KPFM), se utilizan cada vez más en la investigación de baterías de estado sólido para analizar variaciones de conductividad local, cambios de potencial interfacial y mecanismos de degradación a nanoescala.

El funcionamiento del AFM se suele describir en tres modos, según la naturaleza del movimiento de la punta: modo de contacto, también llamado modo estático (a diferencia de los otros dos modos, que se denominan modos dinámicos); modo de golpeteo, también llamado contacto intermitente, modo CA o modo vibratorio, o, tras el mecanismo de detección, AFM de modulación de amplitud; y modo sin contacto, o, de nuevo tras el mecanismo de detección, AFM de modulación de frecuencia.

A pesar de la nomenclatura, el contacto repulsivo puede ocurrir o evitarse tanto en la microscopía de fuerza atómica con modulación de amplitud como en la de modulación de frecuencia, dependiendo de la configuración.

Modo de pulsación

En condiciones ambientales, la mayoría de las muestras desarrollan una capa de menisco líquido. Por ello, mantener la punta de la sonda lo suficientemente cerca de la muestra para que las fuerzas de corto alcance sean detectables, evitando al mismo tiempo que la punta se adhiera a la superficie, representa un problema importante para el modo de contacto en condiciones ambientales. El modo de contacto dinámico (también llamado contacto intermitente, modo CA o modo de golpeteo) se desarrolló para solucionar este problema. ^{[ 12 ]} Actualmente, el modo de golpeteo es el modo de AFM más utilizado cuando se opera en condiciones ambientales o en líquidos.

En el modo de contacto intermitente , el voladizo oscila hacia arriba y hacia abajo a una frecuencia cercana a su frecuencia de resonancia. Esta oscilación se suele lograr con un pequeño elemento piezoeléctrico en el soporte del voladizo, pero también existen otras posibilidades, como un campo magnético alterno (con voladizos magnéticos), voladizos piezoeléctricos o calentamiento periódico con un haz láser modulado. La amplitud de esta oscilación suele variar entre varios nm y 200  nm. En el modo de contacto intermitente, la frecuencia y la amplitud de la señal de excitación se mantienen constantes, lo que resulta en una amplitud constante de la oscilación del voladizo siempre que no haya deriva ni interacción con la superficie. La interacción de las fuerzas que actúan sobre el voladizo cuando la punta se acerca a la superficie ( fuerzas de van der Waals , interacciones dipolo-dipolo , fuerzas electrostáticas , etc.) provoca que la amplitud de la oscilación del voladizo cambie (generalmente disminuya) a medida que la punta se aproxima a la muestra. Esta amplitud se utiliza como parámetro para el servomotor electrónico que controla la altura del voladizo sobre la muestra. El servomotor ajusta la altura para mantener una amplitud de oscilación del voladizo constante mientras este se desplaza sobre la muestra. Por lo tanto, se obtiene una imagen AFM de contacto intermitente al registrar la fuerza de los contactos de la punta con la superficie de la muestra. ^{[ 13 ]}

Aunque las fuerzas máximas aplicadas durante la parte de contacto de la oscilación pueden ser mucho mayores que las utilizadas normalmente en el modo de contacto, el modo de golpeteo generalmente reduce el daño causado a la superficie y a la punta en comparación con la cantidad causada en el modo de contacto. Esto puede explicarse por la corta duración de la fuerza aplicada y porque las fuerzas laterales entre la punta y la muestra son significativamente menores en el modo de golpeteo que en el modo de contacto. La imagen en modo de golpeteo es lo suficientemente suave incluso para la visualización de bicapas lipídicas soportadas o moléculas de polímero individuales adsorbidas (por ejemplo, cadenas de 0,4 nm de espesor de polielectrolitos  sintéticos ) en medio líquido. Con los parámetros de escaneo adecuados, la conformación de moléculas individuales puede permanecer inalterada durante horas, ^{[ 11 ]} e incluso se pueden obtener imágenes de motores moleculares individuales mientras se mueven.

Al operar en modo de contacto intermitente, también se puede registrar la fase de la oscilación del voladizo con respecto a la señal de excitación. Este canal de señal contiene información sobre la energía disipada por el voladizo en cada ciclo de oscilación. Las muestras que contienen regiones con rigidez variable o con diferentes propiedades de adhesión pueden generar un contraste en este canal que no es visible en la imagen topográfica. Sin embargo, extraer las propiedades del material de la muestra de forma cuantitativa a partir de imágenes de fase a menudo no es factible.

Cuando la distancia entre la sonda y la muestra se reduce al rango donde se puede detectar la fuerza atómica, mientras se excita una viga en voladizo en su frecuencia propia natural ( _f₀ ) , la frecuencia de resonancia f de la viga puede variar respecto a su frecuencia de resonancia original. En otras palabras, en el rango donde se puede detectar la fuerza atómica, también se observará un desplazamiento de frecuencia (df = f – f₀). Cuando la distancia entre la sonda y la muestra se encuentra en la _región de no contacto , el desplazamiento de frecuencia aumenta en dirección negativa a medida que la distancia entre la sonda y la muestra disminuye. 

Cuando la muestra presenta concavidad y convexidad, la distancia entre el ápice de la punta y la muestra varía en función de dicha concavidad y convexidad al escanear la muestra en la dirección x-y (sin regular la altura en la dirección z). Como resultado, se produce un desplazamiento de frecuencia. La imagen que representa los valores de frecuencia obtenidos mediante un barrido raster a lo largo de la superficie de la muestra en función de las coordenadas x-y de cada punto de medición se denomina imagen de altura constante.

Por otro lado, el df puede mantenerse constante moviendo la sonda hacia arriba y hacia abajo (véase (3) de la figura 5) en la dirección z mediante retroalimentación negativa (utilizando un bucle de retroalimentación z) mientras se realiza un barrido raster de la superficie de la muestra en la dirección x-y. La imagen en la que se representan las cantidades de retroalimentación negativa (la distancia de movimiento de la sonda hacia arriba y hacia abajo en la dirección z) frente a la coordenada x-y de cada punto de medición es una imagen topográfica. En otras palabras, la imagen topográfica es un rastro de la punta de la sonda regulada de manera que el df sea constante y también puede considerarse como una representación gráfica de una superficie de altura constante del df.

Por lo tanto, la imagen topográfica del AFM no es la morfología exacta de la superficie en sí, sino la imagen influenciada por el orden de enlace entre la sonda y la muestra; sin embargo, se considera que la imagen topográfica del AFM refleja mejor la forma geográfica de la superficie que la imagen topográfica de un microscopio de efecto túnel.

La espectroscopia de fuerza se utiliza en biofísica para medir las propiedades mecánicas de materiales vivos (como tejidos o células) ^{[ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]} o detectar estructuras de diferente rigidez incrustadas en el interior de la muestra mediante tomografía de rigidez. ^{[ 24 ]} Otra aplicación fue medir las fuerzas de interacción entre, por un lado, un material adherido a la punta del voladizo y, por otro, la superficie de partículas libres u ocupadas por el mismo material. A partir de la curva de distribución de la fuerza de adhesión, se ha derivado un valor medio de las fuerzas. Esto permitió realizar una cartografía de la superficie de las partículas, cubiertas o no por el material. ^{[ 25 ]} El AFM también se ha utilizado para el despliegue mecánico de proteínas. ^{[ 26 ]} En tales experimentos, el análisis de las fuerzas medias de despliegue con el modelo apropiado ^{[ 27 ]} conduce a la obtención de información sobre la velocidad de despliegue y los parámetros del perfil de energía libre de la proteína.

Las fuerzas del menisco del agua son de gran interés para las mediciones de AFM en aire. Debido a la humedad ambiental , se forma una fina capa de agua entre la punta y la muestra durante las mediciones en aire. La fuerza capilar resultante genera una fuerte fuerza de atracción que adhiere la punta a la superficie. De hecho, la fuerza de adhesión medida entre la punta y la muestra en aire ambiente con humedad finita suele estar dominada por las fuerzas capilares. En consecuencia, resulta difícil separar la punta de la superficie. Para muestras blandas, incluyendo muchos polímeros y, en particular, materiales biológicos, la fuerte fuerza capilar adhesiva provoca la degradación y destrucción de la muestra durante la obtención de imágenes en modo de contacto. Históricamente, estos problemas fueron una importante motivación para el desarrollo de la obtención de imágenes dinámicas en aire (por ejemplo, el modo de contacto intermitente). Durante la obtención de imágenes en modo de contacto intermitente en aire, aún se forman puentes capilares. Sin embargo, para condiciones de imagen adecuadas, los puentes capilares se forman y se rompen en cada ciclo de oscilación del voladizo normal a la superficie, como se puede inferir del análisis de las curvas de amplitud y fase del voladizo en función de la distancia. ^{[ 35 ]} Como consecuencia, las fuerzas de corte destructivas se reducen en gran medida y se pueden investigar muestras blandas.

Para cuantificar la fuerza capilar de equilibrio, es necesario partir de la ecuación de Laplace para la presión:

${\displaystyle P=\gamma _{L}\left({\frac {1}{r}}_{1}+{\frac {1}{r}}_{0}\right)\simeq {\frac {\gamma _{L}}{r_{eff}}}}$

donde γ _L es la energía superficial y r ₀ y r ₁ se definen en la figura.

La presión se aplica sobre un área de

${\displaystyle A\simeq 2\pi R\simeq [r_{eff}(1+\cos \theta )+h]}$

donde θ es el ángulo entre la superficie de la punta y la superficie del líquido, mientras que h es la diferencia de altura entre el líquido circundante y la parte superior del minisco.

La fuerza que une las dos superficies es

${\displaystyle F=2\pi R\gamma _{L}\left(1+\cos \theta +{\frac {h}{r_{eff}}}\right)}$

La misma fórmula también podría calcularse en función de la humedad relativa.

Gao ^{[ 36 ]} calculó fórmulas para diferentes geometrías de punta. Como ejemplo, la fuerza disminuye un 20% para una punta cónica con respecto a una punta esférica.

Al calcular estas fuerzas, debe distinguirse entre la situación de superficie mojada sobre superficie seca y la situación de superficie mojada sobre superficie mojada.

Para una punta esférica, la fuerza es:

${\displaystyle f_{m}=-2\pi R\gamma _{L}(\cos \theta +\cos \phi )\left(1-{\frac {dh}{dD}}\right)}$para seco sobre húmedo,

${\displaystyle f_{m}=-2\pi R\gamma _{L}{\frac {dr_{0}}{dD}}}$para mojado sobre mojado,

donde θ es el ángulo de contacto de la esfera seca y φ es el ángulo de inmersión, como se muestra en la figura.

Para una punta cónica, la fórmula queda así:

${\displaystyle f_{m}=-2\pi R\gamma _{L}{\frac {\tan \delta }{\cos \delta }}(\cos \theta +\sin \delta )(hD)\left(1-{\frac {dh}{dD}}\right)}$para seco sobre húmedo

${\displaystyle f_{m}=-2\pi R\gamma _{L}\left({\frac {1}{\cos \delta }}+\sin \delta \right)(r_{0})\left({\frac {dr_{0}}{dD}}\right)}$para mojado sobre mojado

donde δ es el semiángulo del cono y r ₀ y h son parámetros del perfil del menisco.

El método más común para medir la deflexión de voladizos es el método de deflexión del haz. En este método, la luz láser de un diodo de estado sólido se refleja en la parte posterior del voladizo y es captada por un detector sensible a la posición (PSD) compuesto por dos fotodiodos muy próximos entre sí , cuya señal de salida es captada por un amplificador diferencial . El desplazamiento angular del voladizo produce que un fotodiodo capte más luz que el otro, generando una señal de salida (la diferencia entre las señales de los fotodiodos normalizada por su suma) que es proporcional a la deflexión del voladizo. La sensibilidad del método de deflexión del haz es muy alta, y en un sistema bien diseñado se puede obtener rutinariamente un nivel de ruido del orden de 10 fm Hz ^{− 1/2 . Aunque a} veces se le denomina método de "palanca óptica", la señal no se amplifica si se alarga la trayectoria del haz. Una trayectoria del haz más larga aumenta el movimiento del punto reflejado en los fotodiodos, pero también lo ensancha en la misma medida debido a la difracción , de modo que la misma cantidad de potencia óptica se transfiere de un fotodiodo a otro. El "apalancamiento óptico" (señal de salida del detector dividida por la deflexión de la viga en voladizo) es inversamente proporcional a la apertura numérica de la óptica de enfoque del haz, siempre que el punto láser enfocado sea lo suficientemente pequeño como para incidir completamente sobre la viga en voladizo. También es inversamente proporcional a la longitud de la viga en voladizo.

La relativa popularidad del método de deflexión de haz se explica por su alta sensibilidad y sencillez de funcionamiento, así como por el hecho de que las vigas en voladizo no requieren contactos eléctricos ni otros tratamientos especiales, por lo que pueden fabricarse de forma relativamente económica con puntas afiladas integradas.

Existen muchos otros métodos para medir la deflexión de haces.

• Detección piezoeléctrica : las microvigas fabricadas con cuarzo ^{[ 37 ]} (como la configuración qPlus ) u otros materiales piezoeléctricos pueden detectar directamente la deflexión como una señal eléctrica. Con este método se han detectado oscilaciones de microvigas de hasta 10 pm.
• Vibrometría láser Doppler : Un vibrómetro láser Doppler puede utilizarse para obtener mediciones de deflexión muy precisas de una viga en voladizo oscilante ^{[ 38 ]} (por lo que solo se utiliza en modo sin contacto). Este método es costoso y solo lo utilizan relativamente pocos grupos.
• Microscopio de efecto túnel (STM): El primer microscopio atómico utilizó un STM con su propio mecanismo de retroalimentación para medir la deflexión. ^{[ 8 ]} Este método es muy difícil de implementar y reacciona lentamente a los cambios de deflexión en comparación con los métodos modernos.
• Interferometría óptica : La interferometría óptica se puede utilizar para medir la deflexión de voladizos. ^{[ 39 ]} Debido a las deflexiones a escala nanométrica medidas en AFM, el interferómetro opera en el régimen de subfranjas, por lo que cualquier variación en la potencia o longitud de onda del láser afecta significativamente la medición. Por estas razones, las mediciones con interferómetro óptico deben realizarse con sumo cuidado (por ejemplo, utilizando fluidos de adaptación de índice entre las uniones de las fibras ópticas) y con láseres muy estables. Por ello, la interferometría óptica se utiliza con poca frecuencia.
• Detección capacitiva : las microvigas recubiertas de metal pueden formar un condensador con otro contacto situado detrás de la microviga. ^{[ 40 ]} La deflexión cambia la distancia entre los contactos y puede medirse como un cambio en la capacitancia.
• Detección piezorresistiva : Los voladizos se pueden fabricar con elementos piezorresistivos que actúan como galgas extensométricas . Mediante un puente de Wheatstone , se puede medir la deformación en el voladizo del AFM debido a la deflexión. ^{[ 41 ]} Esto no se usa comúnmente en aplicaciones de vacío, ya que la detección piezorresistiva disipa energía del sistema, lo que afecta al factor Q de la resonancia.

La microscopía de fuerza atómica ( AFM) presenta varias ventajas sobre el microscopio electrónico de barrido (SEM). A diferencia del microscopio electrónico, que proporciona una proyección bidimensional o una imagen bidimensional de una muestra, la AFM proporciona un perfil de superficie tridimensional. Además, las muestras observadas mediante AFM no requieren tratamientos especiales (como recubrimientos de metal/carbono) que puedan alterar o dañar irreversiblemente la muestra, y no suele presentar artefactos de carga en la imagen final. Mientras que un microscopio electrónico necesita un entorno de vacío costoso para su correcto funcionamiento, la mayoría de los modos de AFM pueden funcionar perfectamente en aire ambiente o incluso en un entorno líquido. Esto permite estudiar macromoléculas biológicas e incluso organismos vivos. En principio, la AFM puede proporcionar una resolución superior a la del SEM. Se ha demostrado que ofrece una verdadera resolución atómica en ultra alto vacío (UHV) y, más recientemente, en entornos líquidos. La AFM de alta resolución es comparable en resolución a la microscopía de efecto túnel y a la microscopía electrónica de transmisión . La AFM también puede combinarse con diversas técnicas de microscopía y espectroscopía óptica, como la microscopía de fluorescencia o la espectroscopía infrarroja, dando lugar a la microscopía óptica de campo cercano por barrido , la nano-FTIR y ampliando aún más su aplicabilidad. Los instrumentos combinados de AFM y óptica se han aplicado principalmente en las ciencias biológicas, pero recientemente han despertado gran interés en la investigación fotovoltaica ^{[ 13 ]} y de almacenamiento de energía ^{[ 46 ]} , las ciencias de los polímeros ^{[ 47 ]} , la nanotecnología ^{[ 48 ] [ 49 ]} e incluso la investigación médica ^{[ 50 ] .}

Una desventaja del AFM en comparación con el microscopio electrónico de barrido (SEM) es el tamaño de la imagen de escaneo individual. En una sola pasada, el SEM puede obtener imágenes de un área del orden de milímetros cuadrados con una profundidad de campo del orden de milímetros, mientras que el AFM solo puede obtener imágenes de un área de escaneo máxima de aproximadamente 150 × 150 micrómetros y una altura máxima del orden de 10 a 20 micrómetros. Un método para mejorar el tamaño del área escaneada para el AFM es mediante el uso de sondas paralelas de manera similar a como se almacenan los datos de los milpiés .

La velocidad de escaneo de un AFM también es una limitación. Tradicionalmente, un AFM no puede escanear imágenes tan rápido como un SEM, requiriendo varios minutos para un escaneo típico, mientras que un SEM es capaz de escanear casi en tiempo real, aunque con una calidad relativamente baja. La velocidad de escaneo relativamente lenta durante la obtención de imágenes con AFM a menudo produce deriva térmica en la imagen ^{[ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]} lo que hace que el AFM sea menos adecuado para medir distancias precisas entre características topográficas en la imagen. Sin embargo, se han sugerido varios diseños de acción rápida ^{[ 54 ] [ 55 ]} para aumentar la productividad del escaneo del microscopio, incluyendo lo que se denomina videoAFM (se obtienen imágenes de calidad razonable con videoAFM a velocidad de video: más rápido que el SEM promedio). Para eliminar las distorsiones de imagen inducidas por la deriva térmica, se han introducido varios métodos. ^{[ 51 ] [ 52 ] [ 53 ]}

Las imágenes AFM también pueden verse afectadas por la no linealidad, la histéresis ^{[ 43 ]} y la fluencia del material piezoeléctrico, así como por la diafonía entre los ejes x , y , z, lo que puede requerir mejoras y filtrado de software. Dicho filtrado podría "aplanar" las características topográficas reales. Sin embargo, los AFM más recientes utilizan software de corrección en tiempo real (por ejemplo, escaneo orientado a características ^{[ 44 ] [ 51 ]} ) o escáneres de bucle cerrado, que prácticamente eliminan estos problemas. Algunos AFM también utilizan escáneres ortogonales separados (en lugar de un solo tubo), que también sirven para eliminar parte de los problemas de diafonía.

Como ocurre con cualquier otra técnica de imagen, existe la posibilidad de que aparezcan artefactos , que podrían deberse a una punta inadecuada, un entorno operativo deficiente o incluso a la propia muestra, como se muestra a la derecha. Estos artefactos son inevitables; sin embargo, su aparición y su impacto en los resultados pueden reducirse mediante diversos métodos. Los artefactos derivados de una punta demasiado rugosa pueden ser causados, por ejemplo, por una manipulación incorrecta o por colisiones con la muestra, ya sea por una velocidad de escaneo excesiva o por una superficie demasiado áspera, lo que provoca el desgaste de la punta.

Debido a la naturaleza de las sondas AFM, normalmente no pueden medir paredes pronunciadas ni salientes. Se pueden utilizar voladizos y microscopios AFM especialmente diseñados para modular la sonda lateralmente, así como verticalmente (como en los modos de contacto dinámico y sin contacto), para medir paredes laterales, aunque esto implica voladizos más caros, menor resolución lateral y artefactos adicionales.