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microscopio de rayos X

Imagen de microscopía de rayos X de una planta de canola viva de 10 días de edad [ 1 ] Un microscopio de rayos X utiliza radiación electromagnética en la banda de rayos X para p...

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Imagen de microscopía de rayos X de una planta de canola viva de 10 días de edad [ 1 ]

Un microscopio de rayos X utiliza radiación electromagnética en la banda de rayos X para producir imágenes ampliadas de los objetos. Dado que los rayos X penetran la mayoría de los objetos, no es necesario prepararlos especialmente para las observaciones con microscopio de rayos X.

A diferencia de la luz visible , los rayos X no se reflejan ni se refractan fácilmente y son invisibles para el ojo humano. Por lo tanto, un microscopio de rayos X expone una película o utiliza un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) para detectar los rayos X que atraviesan la muestra. Se trata de una tecnología de imagen por contraste que utiliza la diferencia en la absorción de rayos X blandos en la región de la ventana del agua  (longitudes de onda: 2,34–4,4 nm, energías: 280–530  eV) por el átomo de carbono (elemento principal que compone la célula viva) y el átomo de oxígeno (elemento del agua).

La radiografía de microfoco también logra una alta magnificación mediante proyección. Un tubo de rayos X de microfoco produce rayos X desde un punto focal extremadamente pequeño (de 5  μm a 0,1  μm). Los rayos X se encuentran en el rango convencional (de 20 a 300  keV) y no se vuelven a enfocar.

Invención y desarrollo

La historia de la microscopía de rayos X se remonta a principios del siglo XX. Después de que el físico alemán Röntgen descubriera los rayos X en 1895, los científicos pronto iluminaron un objeto usando una fuente puntual de rayos X y capturaron imágenes de sombra del objeto con una resolución de varios micrómetros. [ 2 ] En 1918, Einstein señaló que el índice de refracción para los rayos X en la mayoría de los medios debería ser ligeramente mayor que 1, [ 3 ] lo que significa que las partes ópticas refractivas serían difíciles de usar para aplicaciones de rayos X.

Los primeros microscopios de rayos X de Paul Kirkpatrick y Albert Baez utilizaban óptica reflectante de rayos X de incidencia rasante para enfocar los rayos X, que los hacían rebotar en espejos curvos parabólicos con un ángulo de incidencia muy elevado . Un método alternativo para enfocar los rayos X consiste en utilizar una diminuta placa de Fresnel con anillos concéntricos de oro o níquel sobre un sustrato de dióxido de silicio . Sir Lawrence Bragg produjo algunas de las primeras imágenes de rayos X utilizables con su aparato a finales de la década de 1940.

La fusión por confinamiento inercial láser de accionamiento indirecto utiliza un "hohlraum" irradiado con conos de haz láser desde ambos lados de su superficie interna para bañar una microcápsula de fusión en su interior con rayos X suaves de alta intensidad. Los rayos X de mayor energía que penetran el hohlraum pueden visualizarse mediante un microscopio de rayos X como el que se muestra aquí, donde la radiación X está representada en naranja/rojo.

En la década de 1950, Sterling Newberry fabricó un microscopio de rayos X de sombra, que colocaba la muestra entre la fuente y una placa objetivo; esto se convirtió en la base de los primeros microscopios de rayos X comerciales de General Electric Company .

Tras un periodo de silencio en la década de 1960, la microscopía de rayos X volvió a captar la atención en la década de 1970. En 1972, Horowitz y Howell construyeron el primer microscopio de rayos X basado en sincrotrón en el Acelerador de Electrones de Cambridge. [ 4 ] Este microscopio escaneaba muestras utilizando radiación de sincrotrón a través de un pequeño orificio y demostraba las capacidades de la microscopía de transmisión y de fluorescencia. Otros avances de este periodo incluyen la primera demostración holográfica de Sadao Aoki y Seishi Kikuta en Japón, [ 5 ] los primeros TXM que utilizaban placas de zona por Schmahl et al., [ 6 ] y los experimentos de Stony Brook en STXM . [ 7 ] [ 8 ]

El uso de fuentes de luz de sincrotrón abrió nuevas posibilidades para la microscopía de rayos X en la década de 1980. Sin embargo, a medida que muchos grupos construían nuevos microscopios basados ​​en fuentes de sincrotrón, se constató la dificultad de realizar dichos experimentos debido a las limitaciones tecnológicas de la época, como la escasa coherencia de la iluminación, la mala calidad de los elementos ópticos de rayos X y la dificultad de uso de las fuentes de luz. [ 9 ]

Al comenzar la década de 1990, nuevos instrumentos y fuentes de luz impulsaron significativamente la mejora de la microscopía de rayos X. Se demostraron con éxito métodos de microscopía como la tomografía, la criotomografía y la criotomografía. Gracias a su rápido desarrollo, la microscopía de rayos X encontró nuevas aplicaciones en la ciencia del suelo, la geoquímica, la ciencia de los polímeros y el magnetismo. El hardware también se miniaturizó, lo que permitió a los investigadores realizar experimentos en sus propios laboratorios. [ 9 ]

Se pueden obtener fuentes de rayos X de intensidad extremadamente alta de 9,25 keV para microscopía de contraste de fase  de rayos X , desde un punto focal de aproximadamente 10 μm × 10 μm, con una fuente de rayos X no sincrotrón que utiliza un haz de electrones enfocado y un ánodo de metal líquido. Esto se demostró en 2003 y en 2017 se utilizó para obtener imágenes del cerebro de un ratón con un tamaño de vóxel de aproximadamente un micrómetro cúbico (véase más abajo). [ 10 ]  

Con el continuo crecimiento de sus aplicaciones, la microscopía de rayos X se ha convertido en una técnica rutinaria y probada, utilizada en ciencias ambientales y del suelo, geoquímica y cosmoquímica, ciencias de los polímeros, biología, magnetismo y ciencias de los materiales. Ante esta creciente demanda de microscopía de rayos X en estos campos, se están construyendo microscopios basados ​​en sincrotrón, ánodo de metal líquido y otras fuentes de luz de laboratorio en todo el mundo. La óptica y los componentes de rayos X también se están comercializando rápidamente. [ 9 ]

Instrumentación

Una ventana cuadrada de lámina de berilio montada en una caja de acero para sellar la cámara de vacío de un microscopio de rayos X. El berilio, debido a su bajo número atómico (Z) , es altamente transparente a los rayos X.

óptica de rayos X

fuentes de luz de sincrotrón

Fuente de luz avanzada

La Fuente de Luz Avanzada (ALS) en Berkeley, California, alberga el XM-1, un microscopio de rayos X blandos de campo completo operado por el Centro de Óptica de Rayos X y dedicado a diversas aplicaciones en la nanociencia moderna, como materiales nanomagnéticos, ciencias ambientales y de materiales, y biología. El XM-1 utiliza una lente de rayos X para enfocar los rayos X en un CCD, de manera similar a un microscopio óptico. El XM-1 ostentó el récord mundial en resolución espacial con placas de zona de Fresnel de hasta 15  nm y es capaz de combinar una alta resolución espacial con una resolución temporal inferior a 100 ps para estudiar, por ejemplo, la dinámica de espín ultrarrápida. En julio de 2012, un grupo en DESY afirmó haber alcanzado una resolución espacial récord de 10  nm, utilizando el microscopio de escaneo de rayos X duros en PETRA III . [ 11 ]

El ALS también alberga el primer microscopio de rayos X blandos del mundo diseñado para la investigación biológica y biomédica. Este nuevo instrumento, el XM-2, fue diseñado y construido por científicos del Centro Nacional de Tomografía de Rayos X. El XM-2 es capaz de producir tomogramas tridimensionales de células.

Fuente de rayos X con ánodo de metal líquido

Se pueden obtener fuentes de rayos X de intensidad extremadamente alta de 9,25 keV (línea K-alfa del galio) para microscopía de contraste de fase de rayos X, desde un punto focal de aproximadamente 10  µm x 10 µm, con una fuente de rayos X que utiliza un ánodo de galinstan de metal líquido . Esto se demostró en 2003. [ 10 ] El metal fluye desde una boquilla hacia abajo a alta velocidad y la fuente de electrones de alta intensidad se enfoca sobre él. El rápido flujo de metal transporta corriente, pero el flujo físico evita un calentamiento excesivo del ánodo (debido a la disipación de calor por convección forzada), y el alto punto de ebullición del galinstan inhibe la vaporización del ánodo. La técnica se ha utilizado para obtener imágenes del cerebro de ratón en tres dimensiones con un tamaño de vóxel de aproximadamente un micrómetro cúbico. [ 12 ] 

Dispositivos de detección

Transmisión de escaneo

Las fuentes de rayos X blandos adecuadas para la microscopía, como las fuentes de radiación sincrotrón , tienen un brillo bastante bajo en las longitudes de onda requeridas, por lo que un método alternativo para la formación de imágenes es la microscopía de rayos X blandos por transmisión de barrido. En este método, los rayos X se enfocan en un punto y la muestra se escanea mecánicamente a través del punto focal resultante. En cada punto, los rayos X transmitidos se registran mediante un detector, como un contador proporcional o un fotodiodo de avalancha . Este tipo de microscopio de rayos X por transmisión de barrido (STXM) fue desarrollado inicialmente por investigadores de la Universidad de Stony Brook y se empleó en la Fuente Nacional de Luz Sincrotrón del Laboratorio Nacional de Brookhaven .

Resolución

La resolución de la microscopía de rayos X se sitúa entre la del microscopio óptico y la del microscopio electrónico . Su ventaja sobre la microscopía electrónica convencional radica en que permite visualizar muestras biológicas en su estado natural. La microscopía electrónica se utiliza ampliamente para obtener imágenes con resolución nanométrica a subangstrom, pero no permite observar células vivas relativamente gruesas, ya que la muestra debe fijarse químicamente, deshidratarse, incrustarse en resina y luego cortarse en láminas ultrafinas. Sin embargo, cabe mencionar que la criomicroscopía electrónica permite la observación de especímenes biológicos en su estado natural hidratado, aunque incrustados en hielo de agua. Hasta ahora, se han logrado resoluciones de 30 nanómetros utilizando la lente de zona de Fresnel, que forma la imagen mediante rayos X blandos emitidos por un sincrotrón. Recientemente, el uso de rayos X blandos emitidos por plasmas generados por láser, en lugar de radiación sincrotrón, se está popularizando.

Análisis

Además, los rayos X provocan fluorescencia en la mayoría de los materiales, y estas emisiones pueden analizarse para determinar la composición química de un objeto. Otro uso consiste en generar patrones de difracción , un proceso empleado en la cristalografía de rayos X. Mediante el análisis de las reflexiones internas de un patrón de difracción (generalmente con un programa informático), se puede determinar la estructura tridimensional de un cristal , incluso la ubicación de los átomos individuales dentro de sus moléculas. En ocasiones, se utilizan microscopios de rayos X para estos análisis, ya que las muestras son demasiado pequeñas para analizarlas de otra manera.

Aplicaciones biológicas

Una de las primeras aplicaciones de la microscopía de rayos X en biología fue la imagen por contacto, desarrollada por Goby en 1913. En esta técnica, los rayos X blandos irradian una muestra y exponen las emulsiones sensibles a los rayos X que se encuentran debajo. Luego, se registran imágenes tomográficas ampliadas de las emulsiones, que corresponden a los mapas de opacidad de rayos X de la muestra, utilizando un microscopio óptico o un microscopio electrónico. Una ventaja única que la imagen por contacto de rayos X ofrecía sobre la microscopía electrónica era la capacidad de obtener imágenes de materiales biológicos húmedos. Por lo tanto, se utilizó para estudiar las estructuras a micro y nanoescala de plantas, insectos y células humanas. Sin embargo, varios factores, como las distorsiones de la emulsión, las malas condiciones de iluminación y la baja resolución de los métodos para examinar las emulsiones, limitan la resolución de la imagen por contacto. El daño electrónico a las emulsiones y los efectos de difracción también pueden producir artefactos en las imágenes finales. [ 13 ]

La microscopía de rayos X tiene ventajas únicas en términos de resolución a nanoescala y alta capacidad de penetración, ambas necesarias en estudios biológicos. Con el reciente progreso significativo en instrumentos y enfoque, las tres formas clásicas de óptica —difractiva, [ 14 ] reflectiva, [ 15 ] [ 16 ] refractiva [ 17 ] óptica— se han extendido con éxito al rango de rayos X y se han utilizado para investigar las estructuras y la dinámica a escalas celulares y subcelulares. En 2005, Shapiro et al. informaron imágenes celulares de levaduras con una  resolución de 30 nm utilizando microscopía de difracción de rayos X blandos coherentes. [ 18 ] En 2008, se demostró la obtención de imágenes de rayos X de un virus sin teñir. [ 19 ] Un año después, la difracción de rayos X se aplicó para visualizar la estructura tridimensional de un cromosoma humano sin teñir. [ 20 ] La microscopía de rayos X ha demostrado así su gran capacidad para sortear el límite de difracción de los microscopios de luz clásicos; sin embargo, la mejora adicional de la resolución está limitada por los píxeles del detector, los instrumentos ópticos y los tamaños de la fuente.

Una preocupación importante y de larga data en la microscopía de rayos X es el daño por radiación, ya que los rayos X de alta energía producen radicales fuertes y desencadenan reacciones dañinas en muestras húmedas. Por consiguiente, las muestras biológicas generalmente se fijan o liofilizan antes de ser irradiadas con rayos X de alta potencia. También se utilizan comúnmente tratamientos criogénicos rápidos para preservar estructuras hidratadas intactas. [ 21 ]

Véase también

Referencias

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