Microscopía de campo claro

La microscopía de campo claro ( BF ) es la más simple de todas las técnicas de iluminación de microscopía óptica . La iluminación de la muestra se transmite (es decir, se ilumina desde abajo y se observa desde arriba) con luz blanca , y el contraste en la muestra se produce por la atenuación de la luz transmitida en áreas densas de la muestra. La microscopía de campo claro es la más simple de una gama de técnicas utilizadas para la iluminación de muestras en microscopios ópticos, y su simplicidad la convierte en una técnica popular. La apariencia típica de una imagen de microscopía de campo claro es una muestra oscura sobre un fondo brillante, de ahí el nombre.

La trayectoria de la luz de un microscopio de campo claro es extremadamente sencilla y no se requieren componentes adicionales a los que se requieren para la configuración normal del microscopio óptico. Por lo tanto, la trayectoria de la luz consta de:

• una fuente de luz de transiluminación, comúnmente una lámpara halógena en el soporte del microscopio;
• una lente condensadora , que enfoca la luz de la fuente de luz sobre la muestra;
• una lente objetivo , que recoge la luz de la muestra y amplía la imagen;
• oculares y/o una cámara para ver la imagen de muestra.

La microscopía de campo brillante puede utilizar iluminación crítica o Köhler para iluminar la muestra.

La microscopía de campo claro suele tener un bajo contraste con la mayoría de las muestras biológicas, ya que pocas absorben la luz en gran medida. A menudo se requiere tinción para aumentar el contraste, lo que impide su uso en células vivas en muchas situaciones. La iluminación de campo claro es útil para muestras que tienen un color intrínseco, por ejemplo, las mitocondrias que se encuentran en las células.

• Comparación de las técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel tisú (1,559 μm/píxel)
• 
  Iluminación de campo brillante, el contraste de la muestra proviene de la absorción de luz en la muestra.
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  Iluminación con luz polarizada cruzada , el contraste de la muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra.
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  Iluminación de campo oscuro , el contraste de la muestra proviene de la luz dispersada por la muestra.
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  Iluminación de contraste de fase , el contraste de la muestra proviene de la interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de la luz a través de la muestra.

La microscopía de campo brillante es una técnica de microscopía óptica estándar y, por lo tanto, el aumento está limitado por el poder de resolución posible con la longitud de onda de la luz visible .

• Sencillez de instalación, solo se requiere equipo básico.
• Las células vivas se pueden ver con microscopios de campo claro. ^[1]

• Contraste muy bajo en la mayoría de las muestras biológicas;
• El límite práctico de aumento con un microscopio óptico es de alrededor de 1300X. Aunque es posible lograr mayores aumentos, se hace cada vez más difícil mantener la claridad de la imagen a medida que aumenta el aumento; ^[2]
• Baja resolución óptica aparente debido al desenfoque del material desenfocado;
• Las muestras que son naturalmente incoloras y transparentes no se pueden ver bien, por ejemplo, muchos tipos de células de mamíferos. Estas muestras a menudo deben teñirse antes de verlas. Las muestras que sí tienen su propio color se pueden ver sin preparación, por ejemplo, la observación de flujo citoplasmático en células de Chara .

• Reducir o aumentar la cantidad de la fuente de luz mediante el diafragma de iris .
• Uso de un objetivo de inmersión en aceite y un aceite de inmersión especial colocado sobre una cubierta de vidrio sobre la muestra. El aceite de inmersión tiene la misma refracción que el vidrio y mejora la resolución de la muestra observada.
• Uso de métodos de tinción de muestras para uso en microbiología , como tinciones simples ( azul de metileno , safranina , violeta cristal ) y tinciones diferenciales (tinciones negativas, tinciones flagelares, tinciones de endosporas).
• Uso de un filtro de color (normalmente azul) o polarizador en la fuente de luz para resaltar características que no son visibles bajo luz blanca. El uso de filtros es especialmente útil con muestras minerales .

1. Microscopía óptica avanzada vol. 1 Principios y propiedades básicas por Maksymilian Pluta, Elsevier (1988)
2. Microscopía óptica avanzada vol. 2 Métodos especializados de Maksymilian Pluta, Elsevier (1989)
3. Introducción a la microscopía óptica por S. Bradbury, B. Bracegirdle, BIOS Scientific Publishers (1998)
4. Microbiología: principios y exploraciones, de Jacquelyn G. Black, John Wiley & Sons, Inc. (2005)
5. Literatura sobre microscopía e imágenes