Microscopio óptico

Un microscopio simple utiliza una lente o un conjunto de lentes para ampliar un objeto únicamente mediante la magnificación angular, proporcionando al observador una imagen virtual ampliada y derecha . ^{[ 6 ] [ 7 ]} El uso de una sola lente convexa o grupos de lentes se encuentra en dispositivos de aumento simples como la lupa , las lupas y los oculares para telescopios y microscopios.

Un microscopio compuesto utiliza una lente cercana al objeto que se observa para captar la luz (llamada lente objetivo ), que enfoca una imagen real del objeto dentro del microscopio. Esta imagen se magnifica mediante una segunda lente o un grupo de lentes (llamado ocular ) que proporciona al observador una imagen virtual invertida y ampliada del objeto. ^{[ 5 ]}

El uso de una combinación de objetivo compuesto y ocular permite una magnificación angular mucho mayor: Para un objeto de altura${\displaystyle h}$como máximo puede ocupar un tamaño angular no ampliado${\displaystyle \theta _{0}=h/d_{0}}$mientras permanece enfocado, lo cual se logra cuando se coloca a la distancia del punto cercano.${\displaystyle d_{0}}$del ojo (aproximadamente 11 cm). La imagen virtual creada por el microscopio compuesto alcanza un tamaño angular de ${\displaystyle \theta =-hs/f_{\text{objetivo}}f_{\text{ocular}}}$, dónde${\displaystyle s}$es la distancia entre los puntos focales vecinos del objetivo y del ocular. Esta es una magnificación angular de${\displaystyle \theta /\theta _{0}=-sd_{0}/f_{\text{objetivo}}f_{\text{ocular}}}$.

Los microscopios compuestos comunes suelen tener lentes de objetivo intercambiables, lo que permite al usuario ajustar rápidamente el aumento. ^{[ 5 ]} Un microscopio compuesto también permite configuraciones de iluminación más avanzadas, como el contraste de fase .

Existen muchas variantes del diseño del microscopio óptico compuesto para fines especializados. Algunas de estas son diferencias de diseño físico que permiten la especialización para ciertos propósitos:

• Microscopio estereoscópico , un microscopio de baja potencia que proporciona una visión estereoscópica de la muestra, comúnmente utilizado para la disección.
• El microscopio de comparación tiene dos trayectorias de luz separadas que permiten la comparación directa de dos muestras mediante una imagen en cada ojo.
• Microscopio invertido , para estudiar muestras desde abajo; útil para cultivos celulares en líquido o para metalografía.
• Microscopio de inspección de conectores de fibra óptica, diseñado para la inspección de la cara frontal del conector.
• Microscopio portátil , para el estudio de muestras de alta resolución óptica .

Existen otras variantes de microscopio diseñadas para diferentes técnicas de iluminación:

• Microscopio petrográfico , cuyo diseño suele incluir un filtro polarizador, una platina giratoria y una placa de yeso para facilitar el estudio de minerales u otros materiales cristalinos cuyas propiedades ópticas pueden variar con la orientación.
• Microscopio polarizador , similar al microscopio petrográfico.
• Microscopio de contraste de fase , que aplica el método de iluminación de contraste de fase.
• Microscopio de epifluorescencia , diseñado para el análisis de muestras que incluyen fluoróforos.
• Microscopio confocal , una variante ampliamente utilizada de la iluminación epifluorescente que emplea un láser de barrido para iluminar una muestra y generar fluorescencia.
• Microscopio de dos fotones , utilizado para obtener imágenes de fluorescencia a mayor profundidad en medios dispersivos y reducir el fotoblanqueo, especialmente en muestras vivas.
• Microscopio de estudiante: un microscopio a menudo de baja potencia con controles simplificados y, a veces, óptica de baja calidad, diseñado para uso escolar o como instrumento de iniciación para niños. ^{[ 8 ]}
• Ultramicroscopio , un microscopio óptico adaptado que utiliza la dispersión de la luz para permitir la visualización de partículas diminutas cuyo diámetro es inferior o cercano a la longitud de onda de la luz visible (alrededor de 500 nanómetros); en su mayor parte obsoleto desde la llegada de los microscopios electrónicos.
• El microscopio Raman potenciado por punta es una variante del microscopio óptico basado en la espectroscopia Raman potenciada por punta , sin los límites de resolución tradicionales basados ​​en la longitud de onda. ^{[ 9 ] [ 10 ]} Este microscopio se implementa principalmente en plataformas de microscopios de sonda de barrido utilizando herramientas totalmente ópticas.

Un microscopio digital es un microscopio equipado con una cámara digital que permite la observación de una muestra mediante un ordenador . Los microscopios también pueden controlarse parcial o totalmente por ordenador, con diversos grados de automatización. La microscopía digital permite un análisis más profundo de la imagen, por ejemplo, la medición de distancias y áreas, y la cuantificación de una tinción fluorescente o histológica .

También se comercializan microscopios digitales de baja potencia, conocidos como microscopios USB . Estos son esencialmente cámaras web con una lente macro de alta potencia y, por lo general, no utilizan transiluminación . La cámara se conecta directamente al puerto USB de una computadora para mostrar las imágenes directamente en el monitor. La iluminación de alta potencia suele provenir de una o varias fuentes LED ubicadas junto a la lente de la cámara.

La microscopía digital con niveles de luz muy bajos para evitar daños a muestras biológicas vulnerables está disponible mediante cámaras digitales sensibles de conteo de fotones . Se ha demostrado que una fuente de luz que proporciona pares de fotones entrelazados puede minimizar el riesgo de daño a las muestras más sensibles a la luz. En esta aplicación de la imagen fantasma a la microscopía de baja emisión de fotones, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno correlacionado espacialmente con un compañero entrelazado en la banda visible para una obtención de imágenes eficiente mediante una cámara de conteo de fotones. ^{[ 11 ]}

Los primeros microscopios eran lupas de una sola lente con aumento limitado, que datan al menos del siglo XIII, cuando se generalizó el uso de lentes en las gafas . ^{[ 12 ]}

Los microscopios compuestos aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620 ^{[ 13 ] [ 1 ]} incluyendo uno demostrado por Cornelis Drebbel en Londres (alrededor de 1621) y uno exhibido en Roma en 1624. ^{[ 14 ] [ 1 ]}

Se desconoce quién inventó realmente el microscopio compuesto, aunque a lo largo de los años se han hecho muchas afirmaciones. Entre ellas, una afirmación realizada 35 ^{[ 15 ]} años después de su aparición por el fabricante de gafas holandés Johannes Zachariassen de que su padre, Zacharias Janssen , inventó el microscopio compuesto y/o el telescopio ya en 1590. El testimonio de Johannes, que algunos consideran dudoso, ^{[ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]} retrasa tanto la fecha de la invención que Zacharias habría sido un niño en ese momento, lo que lleva a especular que, para que la afirmación de Johannes sea cierta, el microscopio compuesto tendría que haber sido inventado por el abuelo de Johannes, Hans Martens. ^{[ 17 ]} Otra afirmación es que el competidor de Janssen, Hans Lippershey (quien solicitó la primera patente de telescopio en 1608) también inventó el microscopio compuesto. ^{[ 19 ]} Otros historiadores señalan al innovador holandés Cornelis Drebbel con su microscopio compuesto de 1621. ^{[ 14 ] [ 1 ]}

Galileo Galilei es citado a veces como inventor del microscopio compuesto. Después de 1610, descubrió que podía enfocar su telescopio para ver objetos pequeños, como moscas, de cerca ^{[ 20 ]} y/o podía mirar a través del extremo opuesto al revés para magnificar objetos pequeños. ^{[ 21 ]} El único inconveniente era que su telescopio de 2 pies de largo tenía que extenderse a 6 pies para ver objetos tan cerca. ^{[ 22 ]} Después de ver el microscopio compuesto construido por Drebbel exhibido en Roma en 1624, Galileo construyó su propia versión mejorada. ^{[ 14 ] [ 1 ]} En 1625, Giovanni Faber acuñó el nombre de microscopio para el microscopio compuesto que Galileo presentó a la Accademia dei Lincei en 1624 ^{[ 23 ]} (Galileo lo había llamado " occhiolino " o " ojo pequeño "). Faber acuñó el nombre a partir de las palabras griegas μικρόν (micron), que significa "pequeño", y σκοπεῖν (skopein), que significa "mirar", un nombre que pretendía ser análogo a "telescopio", otra palabra acuñada por los linceos. ^{[ 24 ]}

Christiaan Huygens , otro holandés, desarrolló a finales del siglo XVII un sencillo sistema ocular de dos lentes con corrección acromática , lo que supuso un gran avance en el desarrollo del microscopio. El ocular de Huygens se sigue fabricando hoy en día, pero presenta un campo de visión reducido y otras pequeñas desventajas.

Se atribuye a Antonie van Leeuwenhoek (1632-1724) el haber dado a conocer el microscopio a los biólogos, aunque ya en el siglo XVI se fabricaban lentes de aumento simples. Los microscopios caseros de van Leeuwenhoek eran microscopios simples, con una sola lente muy pequeña pero potente. Eran incómodos de usar, pero le permitieron ver imágenes detalladas. Fueron necesarios unos 150 años de desarrollo óptico para que el microscopio compuesto pudiera proporcionar la misma calidad de imagen que los microscopios simples de van Leeuwenhoek, debido a las dificultades para configurar múltiples lentes. En la década de 1850, John Leonard Riddell , profesor de Química en la Universidad de Tulane , inventó el primer microscopio binocular práctico mientras realizaba una de las primeras y más extensas investigaciones microscópicas estadounidenses sobre el cólera . ^{[ 26 ] [ 27 ]}

Si bien la tecnología básica de microscopía y la óptica han estado disponibles durante más de 400 años, es mucho más reciente el desarrollo de las técnicas de iluminación de muestras para generar las imágenes de alta calidad que se ven hoy en día.

En agosto de 1893, August Köhler desarrolló la iluminación de Köhler . Este método de iluminación de muestras produce una iluminación extremadamente uniforme y supera muchas de las limitaciones de las técnicas anteriores. Antes del desarrollo de la iluminación de Köhler, la imagen de la fuente de luz, por ejemplo, el filamento de una bombilla , siempre era visible en la imagen de la muestra.

El Premio Nobel de Física fue otorgado al físico neerlandés Frits Zernike en 1953 por su desarrollo de la iluminación por contraste de fase , que permite obtener imágenes de muestras transparentes. Mediante la interferencia , en lugar de la absorción de luz, se pueden obtener imágenes de muestras extremadamente transparentes, como células de mamíferos vivas , sin necesidad de utilizar técnicas de tinción. Tan solo dos años después, en 1955, Georges Nomarski publicó la teoría de la microscopía de contraste de interferencia diferencial , otra técnica de obtención de imágenes basada en la interferencia .

La microscopía biológica moderna depende en gran medida del desarrollo de sondas fluorescentes para estructuras específicas dentro de la célula. A diferencia de la microscopía óptica transiluminada convencional, en la microscopía de fluorescencia la muestra se ilumina a través del objetivo con un rango estrecho de longitudes de onda. Esta luz interactúa con los fluoróforos de la muestra, que emiten luz de mayor longitud de onda . Es esta luz emitida la que conforma la imagen.

Desde mediados del siglo XX, se han utilizado colorantes químicos fluorescentes, como el DAPI , que se une al ADN , para marcar estructuras específicas dentro de la célula. Entre los avances más recientes se incluyen la inmunofluorescencia , que utiliza anticuerpos marcados con fluorescencia para reconocer proteínas específicas en una muestra, y proteínas fluorescentes como la GFP, que una célula viva puede expresar, haciéndola fluorescente.

El ocular , o lente ocular, es un cilindro que contiene dos o más lentes; su función es enfocar la imagen para el ojo. El ocular se inserta en el extremo superior del tubo del microscopio. Los oculares son intercambiables y se pueden usar muchos con diferentes grados de aumento. Los aumentos típicos para los oculares incluyen 5×, 10× (el más común), 15× y 20×. En algunos microscopios de alto rendimiento, la configuración óptica de la lente objetivo y el ocular se ajusta para obtener el mejor rendimiento óptico posible. Esto ocurre con mayor frecuencia en los objetivos apocromáticos .

La torreta del objetivo, revólver o pieza giratoria del cabezal es la parte que sostiene el conjunto de lentes objetivo. Permite al usuario cambiar entre lentes objetivo. ^{[ 28 ]}

En la parte inferior de un microscopio óptico compuesto típico, hay uno o más objetivos que recogen la luz de la muestra. El objetivo suele estar en una carcasa cilíndrica que contiene una lente compuesta de vidrio, ya sea de un solo elemento o de varios. Normalmente, hay alrededor de tres objetivos atornillados a un revólver circular que se puede girar para seleccionar el objetivo deseado. Estos sistemas están diseñados para ser parfocales , lo que significa que al cambiar de una lente a otra en el microscopio, la muestra permanece enfocada . Los objetivos de microscopio se caracterizan por dos parámetros: el aumento y la apertura numérica . El primero suele oscilar entre 5× y 100×, mientras que la segunda oscila entre 0,14 y 0,7, lo que corresponde a distancias focales de aproximadamente 40 a 2  mm, respectivamente. Los objetivos con mayor aumento normalmente tienen una mayor apertura numérica y una menor profundidad de campo en la imagen resultante. Algunos objetivos de alto rendimiento pueden requerir oculares compatibles para ofrecer el mejor rendimiento óptico.

Objetivo de inmersión en aceite

Algunos microscopios utilizan objetivos de inmersión en aceite o en agua para obtener mayor resolución a alta magnificación. Estos se emplean con un material de índice de refracción equivalente, como aceite de inmersión o agua, y un cubreobjetos del mismo tipo entre la lente del objetivo y la muestra. El índice de refracción del material de índice de refracción equivalente es mayor que el del aire, lo que permite que la lente del objetivo tenga una apertura numérica mayor (superior a 1), de modo que la luz se transmita desde la muestra a la cara exterior de la lente del objetivo con una refracción mínima. Se pueden alcanzar aperturas numéricas de hasta 1,6. ^{[ 29 ]} La mayor apertura numérica permite captar más luz, lo que posibilita la observación detallada de detalles más pequeños. Una lente de inmersión en aceite suele tener una magnificación de 40 a 100×.

Los mandos de ajuste permiten mover la platina hacia arriba y hacia abajo, con ajustes independientes para el enfoque grueso y fino. Estos mismos controles permiten adaptar el microscopio a muestras de distinto grosor. En los diseños más antiguos de microscopios, las ruedas de ajuste de enfoque movían el tubo del microscopio hacia arriba o hacia abajo con respecto al soporte y la platina era fija.

El conjunto óptico se fija tradicionalmente a un brazo rígido, que a su vez se apoya en una robusta base en forma de U para proporcionar la rigidez necesaria. El ángulo del brazo puede ser ajustable para permitir la modificación del ángulo de visión.

El marco proporciona un punto de montaje para diversos controles del microscopio. Normalmente, esto incluye controles de enfoque, generalmente una rueda moleteada grande para ajustar el enfoque grueso, junto con una rueda moleteada más pequeña para controlar el enfoque fino. Otras características pueden ser controles de la lámpara y/o controles para ajustar el condensador.

La platina es una plataforma situada debajo del objetivo que sostiene la muestra que se está observando. En el centro de la platina hay un orificio por donde pasa la luz para iluminar la muestra. Generalmente, la platina cuenta con brazos para sujetar portaobjetos (placas de vidrio rectangulares, con unas dimensiones típicas de 25 × 75  mm, sobre las que se monta la muestra).

Con aumentos superiores a 100×, mover una muestra manualmente no es práctico. Una platina mecánica, típica de los microscopios de gama media y alta, permite realizar pequeños movimientos de la muestra mediante perillas de control que la reposicionan según se desee. Si un microscopio no incluye originalmente una platina mecánica, es posible añadirle una.

Todas las etapas se mueven hacia arriba y hacia abajo para enfocar. Con una platina mecánica, las diapositivas se mueven sobre dos ejes horizontales para posicionar la muestra y examinar sus detalles.

El enfoque comienza con un aumento bajo para que el usuario centre la muestra en la platina. Al aumentar el aumento, es necesario elevar la platina verticalmente para reenfocar y, posiblemente, ajustar ligeramente la posición horizontal de la muestra. Estos ajustes horizontales son la razón de ser de una platina mecánica.

Debido a la dificultad de preparar las muestras y montarlas en portaobjetos, para los niños lo mejor es empezar con portaobjetos preparados que estén centrados y que se enfoquen fácilmente, independientemente del nivel de enfoque utilizado.

Se pueden utilizar diversas fuentes de luz. En su forma más sencilla, la luz natural se dirige mediante un espejo . Sin embargo, la mayoría de los microscopios cuentan con su propia fuente de luz ajustable y controlable, a menudo una lámpara halógena , aunque la iluminación con LED y láseres es cada vez más común. La iluminación Köhler suele estar presente en instrumentos más caros.

El condensador es una lente diseñada para enfocar la luz de la fuente de iluminación sobre la muestra. También puede incluir otros componentes, como un diafragma o filtros, para controlar la calidad e intensidad de la iluminación. Para técnicas de iluminación como la microscopía de campo oscuro , contraste de fase y contraste de interferencia diferencial , es necesario alinear con precisión componentes ópticos adicionales en la trayectoria de la luz.

La potencia o aumento real de un microscopio óptico compuesto es el producto de la potencia del ocular y del objetivo. Por ejemplo, un aumento de 10x en el ocular y de 100x en el objetivo da como resultado un aumento total de 1000x. Entornos modificados, como el uso de aceite o luz ultravioleta, pueden aumentar la resolución y permitir la observación de detalles con aumentos superiores a 1000x.

Existen numerosas técnicas que modifican la trayectoria de la luz para generar una imagen con mayor contraste a partir de una muestra. Entre las principales técnicas para aumentar el contraste se incluyen la luz polarizada cruzada , el campo oscuro , el contraste de fase y la iluminación por contraste de interferencia diferencial . Una técnica reciente ( Sarfus ) combina la luz polarizada cruzada con portaobjetos de contraste mejorado para la visualización de muestras nanométricas.

• Cuatro ejemplos de técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel tisú . 1,559 μm/píxel.
• 
  En la iluminación de campo claro , el contraste de la muestra proviene de la absorción de luz en la muestra.
• 
  Mediante iluminación con luz polarizada cruzada , el contraste de la muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra.
• 
  En la iluminación de campo oscuro , el contraste de la muestra proviene de la luz dispersada por la misma.
• 
  En la iluminación por contraste de fase , el contraste de la muestra proviene de la interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de la luz a través de la muestra.

Los microscopios modernos permiten mucho más que la simple observación de la imagen de luz transmitida de una muestra; existen numerosas técnicas que se pueden utilizar para obtener otros tipos de datos. La mayoría de estas técnicas requieren equipo adicional además de un microscopio compuesto básico.

• Luz reflejada o iluminación incidente (para el análisis de estructuras superficiales)
• Microscopía de fluorescencia, ambas:

• microscopía de epifluorescencia
• Microscopía confocal

• Microespectroscopia (donde un espectrofotómetro UV-visible está integrado con un microscopio óptico)
• microscopía ultravioleta
• Microscopía de infrarrojo cercano
• Microscopía de transmisión múltiple ^{[ 30 ]} para la mejora del contraste y la reducción de aberraciones.
• Automatización (para el escaneo automático de una muestra grande o la captura de imágenes)

Existen diversas técnicas para alcanzar resoluciones superiores al límite de luz transmitida descrito anteriormente. Las técnicas holográficas, descritas por Courjon y Bulabois en 1979, también permiten superar este límite de resolución, si bien la resolución se vio restringida en su análisis experimental. ^{[ 39 ]}

Utilizando muestras fluorescentes, se dispone de más técnicas. Algunos ejemplos son Vertico SMI , la microscopía óptica de barrido de campo cercano que utiliza ondas evanescentes y la depleción por emisión estimulada . En 2005, se describió un microscopio capaz de detectar una sola molécula como herramienta didáctica. ^{[ 40 ]}

A pesar de los importantes avances logrados en la última década, las técnicas para superar el límite de difracción siguen siendo limitadas y especializadas.

Si bien la mayoría de las técnicas se centran en aumentar la resolución lateral, también existen algunas que permiten el análisis de muestras extremadamente delgadas. Por ejemplo, los métodos de Sarfus colocan la muestra delgada sobre una superficie que mejora el contraste, lo que permite visualizar directamente películas de tan solo 0,3 nanómetros de espesor.

El 8 de octubre de 2014, el Premio Nobel de Química fue otorgado a Eric Betzig , William Moerner y Stefan Hell por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia de superresolución . ^{[ 41 ] [ 42 ]}

Microscopía de localización SPDMphymod

La SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral), tecnología básica de microscopía de localización, es un proceso óptico de microscopía de fluorescencia que permite mediciones de posición, distancia y ángulo en partículas "ópticamente aisladas" (por ejemplo, moléculas) muy por debajo del límite teórico de resolución de la microscopía óptica. "Ópticamente aislada" significa que, en un momento dado, solo se registra una partícula/molécula dentro de una región cuyo tamaño está determinado por la resolución óptica convencional (típicamente de aproximadamente 200-250  nm de diámetro ). Esto es posible cuando las moléculas dentro de dicha región presentan diferentes marcadores espectrales (por ejemplo, diferentes colores u otras diferencias útiles en la emisión de luz de diferentes partículas). ^{[ 45 ] [ 46 ] [ 47 ] [ 48 ]}

Muchos colorantes fluorescentes estándar como GFP , colorantes Alexa, colorantes Atto, Cy2/Cy3 y moléculas de fluoresceína pueden utilizarse para microscopía de localización, siempre que se cumplan ciertas condiciones fotofísicas. Mediante esta tecnología denominada SPDMphymod (fluoróforos físicamente modificables), basta con una única longitud de onda láser de intensidad adecuada para la nanoimagen. ^{[ 49 ]}

STED

La depleción por emisión estimulada (STED) es un ejemplo sencillo de cómo es posible obtener una resolución superior al límite de difracción, pero presenta limitaciones importantes. STED es una técnica de microscopía de fluorescencia que utiliza una combinación de pulsos de luz para inducir fluorescencia en una pequeña subpoblación de moléculas fluorescentes en una muestra. Cada molécula produce un punto de luz limitado por difracción en la imagen, y el centro de cada uno de estos puntos corresponde a la ubicación de la molécula. Dado que el número de moléculas fluorescentes es bajo, es improbable que los puntos de luz se superpongan y, por lo tanto, pueden ubicarse con precisión. Este proceso se repite muchas veces para generar la imagen. Stefan Hell, del Instituto Max Planck de Química Biofísica, recibió el 10.º Premio Alemán del Futuro en 2006 y el Premio Nobel de Química en 2014 por el desarrollo del microscopio STED y las metodologías asociadas. ^{[ 51 ]}

• Van Helden, Albert; Dupré, Sven; Van Gent, Rob (2011). Los orígenes del telescopio . Prensa de la Universidad de Ámsterdam. ISBN 978-90-6984-615-6.