Microscopía de contraste de fase

La microscopía de contraste de fase (PCM) es una técnica de microscopía óptica que convierte los cambios de fase de la luz que atraviesa una muestra transparente en variaciones de brillo en la imagen. Los cambios de fase en sí mismos son invisibles, pero se hacen visibles cuando se muestran como variaciones de brillo.

Cuando las ondas de luz viajan a través de un medio distinto del vacío , la interacción con este provoca cambios en la amplitud y la fase de la onda , que dependen de las propiedades del medio. Los cambios en la amplitud (brillo) se deben a la dispersión y absorción de la luz, procesos que a menudo dependen de la longitud de onda y pueden generar colores. Los equipos fotográficos y el ojo humano solo son sensibles a las variaciones de amplitud. Por lo tanto, sin adaptaciones especiales, los cambios de fase son invisibles. Sin embargo, estos cambios suelen transmitir información importante.

La microscopía de contraste de fase es particularmente importante en biología. Revela muchas estructuras celulares que son invisibles con un microscopio de campo claro , como se ejemplifica en la figura. Estas estructuras se hicieron visibles para los primeros microscopistas mediante tinción , pero esto requería una preparación adicional y la muerte de las células. El microscopio de contraste de fase hizo posible que los biólogos estudiaran las células vivas y cómo proliferan a través de la división celular . Es uno de los pocos métodos disponibles para cuantificar la estructura y los componentes celulares sin usar fluorescencia . ^{[ 1 ]} Después de su invención a principios de la década de 1930, ^{[ 2 ]} la microscopía de contraste de fase demostró ser un avance tan grande en la microscopía que su inventor, Frits Zernike, recibió el Premio Nobel de Física en 1953. ^{[ 3 ]} La mujer que fabricó este microscopio, Caroline Bleeker , a menudo permanece sin reconocimiento.

El principio básico para hacer visibles los cambios de fase en la microscopía de contraste de fase consiste en separar la luz de iluminación (de fondo) de la luz dispersada por la muestra (que constituye los detalles del primer plano) y manipularlas de forma diferente.

La luz de iluminación en forma de anillo (representada en verde en la figura) que pasa por el anillo del condensador es enfocada sobre la muestra por el condensador. Parte de la luz de iluminación es dispersada por la muestra (amarillo). La luz restante no se ve afectada por la muestra y forma la luz de fondo (rojo). Al observar una muestra biológica sin teñir, la luz dispersada es débil y típicamente está desfasada en −90° (debido tanto al grosor típico de las muestras como a la diferencia del índice de refracción entre el tejido biológico y el medio circundante) con respecto a la luz de fondo. Esto hace que el primer plano (vector azul en la figura adjunta) y el fondo (vector rojo) tengan casi la misma intensidad, lo que resulta en un bajo contraste de imagen .

En un microscopio de contraste de fase, el contraste de la imagen se incrementa de dos maneras: generando interferencia constructiva entre los rayos de luz dispersados ​​y de fondo en las regiones del campo de visión que contienen la muestra, y reduciendo la cantidad de luz de fondo que llega al plano de la imagen. ^{[ 4 ]} Primero, la luz de fondo se desfasa −90° al pasarla a través de un anillo de desfase, lo que elimina la diferencia de fase entre el fondo y los rayos de luz dispersados.

Cuando la luz se enfoca en el plano de la imagen (donde se coloca la cámara o el ocular), este desfase provoca que la luz de fondo y los rayos de luz dispersa provenientes de las regiones del campo de visión que contienen la muestra (es decir, el primer plano) interfieran constructivamente , lo que resulta en un aumento del brillo de estas áreas en comparación con las regiones que no contienen la muestra. Finalmente, el fondo se atenúa entre un 70 % y un 90 % mediante un anillo de filtro de densidad neutra ; este método maximiza la cantidad de luz dispersa generada por la luz de iluminación, a la vez que minimiza la cantidad de luz de iluminación que llega al plano de la imagen. Parte de la luz dispersa que ilumina toda la superficie del filtro se desfasará y atenuará por los anillos, pero en mucha menor medida que la luz de fondo, que solo ilumina los anillos de desfase y del filtro de densidad neutra.

Lo anterior describe el contraste de fase negativo . En su forma positiva , la luz de fondo se desfasa +90°. Por lo tanto, la luz de fondo estará desfasada 180° con respecto a la luz dispersa. La luz dispersa se restará de la luz de fondo para formar una imagen con un primer plano más oscuro y un fondo más claro, como se muestra en la primera figura. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]}

El éxito del microscopio de contraste de fase ha dado lugar a varios métodos posteriores de obtención de imágenes de fase . En 1952, Georges Nomarski patentó lo que hoy se conoce como microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) . ^{[ 8 ]} Esta técnica mejora el contraste creando sombras artificiales, como si el objeto se iluminara lateralmente. Sin embargo, la microscopía DIC no es adecuada cuando el objeto o su contenedor alteran la polarización. Con el creciente uso de contenedores de plástico polarizantes en biología celular, la microscopía DIC está siendo reemplazada progresivamente por la microscopía de contraste de modulación de Hoffman , inventada por Robert Hoffman en 1975. ^{[ 9 ]}

Los métodos tradicionales de contraste de fase mejoran el contraste ópticamente, combinando la información de brillo y fase en una sola imagen. Desde la introducción de la cámara digital a mediados de la década de 1990, se han desarrollado varios métodos nuevos de imagen de fase digital, conocidos colectivamente como microscopía cuantitativa de contraste de fase . Estos métodos crean digitalmente dos imágenes separadas: una imagen de campo claro ordinaria y una denominada imagen de desplazamiento de fase . En cada punto de la imagen, la imagen de desplazamiento de fase muestra el desplazamiento de fase cuantificado inducido por el objeto, que es proporcional al espesor óptico del objeto. ^{[ 10 ]} De esta manera, la medición del campo óptico asociado puede remediar los artefactos de halo asociados con el contraste de fase convencional al resolver un problema inverso óptico para reconstruir computacionalmente el potencial de dispersión del objeto. ^{[ 11 ]}

• Imágenes de células vivas
• Imágenes de contraste de fase
• Imágenes de rayos X de contraste de fase

• Introducción a la microscopía óptica : microscopía de contraste de fase por la Universidad Estatal de Florida.
• Microscopios de contraste de fase y de campo oscuro (Universidad Paris-Sud)
• Partes del microscopio que debes conocer.