Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Microscopía confocal

Principio de funcionamiento de los microscopios de fluorescencia y confocales La microscopía confocal es una técnica de imagen óptica que aumenta la resolución y el contraste de...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita
Principio de funcionamiento de los microscopios de fluorescencia y confocales

La microscopía confocal es una técnica de imagen óptica que aumenta la resolución y el contraste de una micrografía mediante el uso de un orificio estenopeico espacial para bloquear la luz desenfocada durante la formación de la imagen. [ 1 ] La captura de múltiples imágenes bidimensionales a diferentes profundidades en una muestra permite la reconstrucción de estructuras tridimensionales (un proceso conocido como seccionamiento óptico ) dentro de un objeto. Esta técnica se utiliza ampliamente en las comunidades científicas e industriales, y sus aplicaciones típicas se encuentran en las ciencias biológicas , la inspección de semiconductores y la ciencia de los materiales .

En un microscopio convencional, la luz atraviesa la muestra hasta donde puede penetrar, mientras que un microscopio confocal solo enfoca un haz de luz más pequeño a una profundidad específica. El microscopio confocal de barrido láser (CLSM) logra una profundidad de campo controlada y muy limitada.

Concepto básico

Principio del sensor puntual confocal según la patente de Minsky.
Proteína de fusión GFP expresada en Nicotiana benthamiana . La fluorescencia es visible mediante microscopía confocal.

El principio de la imagen confocal fue patentado en 1957 por Marvin Minsky [ 2 ] y tiene como objetivo superar algunas limitaciones de los microscopios de fluorescencia de campo amplio tradicionales . [ 3 ] En un microscopio de fluorescencia convencional (es decir, de campo amplio) , toda la muestra se inunda uniformemente con luz de una fuente de luz. Todas las partes de la muestra pueden excitarse al mismo tiempo y la fluorescencia resultante es detectada por el fotodetector o la cámara del microscopio , incluyendo una gran parte de fondo desenfocada. En contraste, un microscopio confocal utiliza iluminación puntual (véase Función de Dispersión de Punto ) y un orificio en un plano ópticamente conjugado frente al detector para eliminar la señal fuera de foco; el nombre "confocal" proviene de esta configuración. Como solo se puede detectar la luz producida por la fluorescencia muy cerca del plano focal , la resolución óptica de la imagen , particularmente en la dirección de profundidad de la muestra, es mucho mejor que la de los microscopios de campo amplio. Sin embargo, dado que gran parte de la luz de la fluorescencia de la muestra se bloquea en el orificio, esta mayor resolución se obtiene a costa de una menor intensidad de la señal, por lo que a menudo se requieren exposiciones prolongadas . Para compensar esta caída de señal después del orificio , la intensidad de la luz se detecta mediante un detector sensible, generalmente un tubo fotomultiplicador (PMT) o un fotodiodo de avalancha , que transforma la señal luminosa en una señal eléctrica. [ 4 ]

Dado que solo se ilumina un punto de la muestra a la vez, la obtención de imágenes 2D o 3D requiere escanear sobre una trama regular (es decir, un patrón rectangular de líneas de escaneo paralelas) en la muestra. El haz se escanea a través de la muestra en el plano horizontal mediante uno o más espejos oscilantes ( controlados por servomotores ). Este método de escaneo suele tener una baja latencia de respuesta y la velocidad de escaneo se puede variar. Los escaneos más lentos proporcionan una mejor relación señal-ruido , lo que resulta en un mejor contraste .

El grosor alcanzable del plano focal viene determinado principalmente por la longitud de onda de la luz utilizada dividida por la apertura numérica del objetivo , pero también por las propiedades ópticas de la muestra. El fino seccionamiento óptico posible hace que este tipo de microscopios sean especialmente adecuados para la obtención de imágenes 3D y el análisis de la superficie de las muestras.

Las sucesivas secciones forman una «pila Z», que puede procesarse para crear una imagen 3D o fusionarse en una pila 2D (principalmente se toma la intensidad máxima del píxel; otros métodos comunes incluyen el uso de la desviación estándar o la suma de los píxeles). [ 1 ]

La microscopía confocal proporciona la capacidad de realizar cortes ópticos seriados, directos y no invasivos de especímenes vivos, gruesos e intactos con una preparación mínima de la muestra, así como una mejora marginal en la resolución lateral en comparación con la microscopía de campo amplio. [ 4 ] Las muestras biológicas a menudo se tratan con colorantes fluorescentes para hacer visibles objetos específicos. Sin embargo, la concentración real del colorante puede ser baja para minimizar la alteración de los sistemas biológicos: algunos instrumentos pueden rastrear moléculas fluorescentes individuales. Además, las técnicas transgénicas pueden crear organismos que producen sus propias moléculas quiméricas fluorescentes (como una fusión de GFP, proteína verde fluorescente con la proteína de interés). Los microscopios confocales funcionan según el principio de excitación puntual en la muestra (punto limitado por difracción) y detección puntual de la señal fluorescente resultante. Un orificio en el detector proporciona una barrera física que bloquea la fluorescencia fuera de foco. Solo se registra el punto enfocado, o punto central del disco de Airy .

Técnicas utilizadas para el escaneo horizontal

Esta proyección de múltiples imágenes confocales, tomadas en las instalaciones de microscopía óptica del EMBL , muestra un grupo de diatomeas con paredes celulares cian, cloroplastos rojos, ADN azul y membranas y orgánulos verdes.

Existen cuatro tipos de microscopios confocales disponibles comercialmente:

Los microscopios confocales de barrido láser utilizan múltiples espejos (normalmente 2 o 3 que escanean linealmente a lo largo de los ejes x e y) para escanear el láser sobre la muestra y "desescanear" la imagen a través de un orificio y un detector fijos. Este proceso suele ser lento y no funciona para la obtención de imágenes en tiempo real, pero puede ser útil para crear imágenes representativas de alta resolución de muestras fijas .

Los microscopios confocales de disco giratorio ( disco de Nipkow ) utilizan una serie de orificios móviles en un disco para escanear puntos de luz. Dado que una serie de orificios escanea un área en paralelo, cada orificio puede permanecer sobre un área específica durante más tiempo, lo que reduce la energía de excitación necesaria para iluminar una muestra en comparación con los microscopios de escaneo láser. La menor energía de excitación reduce la fototoxicidad y el fotoblanqueo de la muestra, lo que a menudo lo convierte en el sistema preferido para la obtención de imágenes de células u organismos vivos.

Los microscopios confocales de doble disco giratorio o con microlentes funcionan según los mismos principios que los microscopios confocales de disco giratorio, con la diferencia de que un segundo disco giratorio con microlentes se coloca antes del disco con los orificios. Cada orificio tiene una microlente asociada. Las microlentes capturan una banda ancha de luz y la enfocan en cada orificio, aumentando significativamente la cantidad de luz que llega a cada uno y reduciendo la cantidad de luz bloqueada por el disco giratorio. Por lo tanto, los microscopios confocales con microlentes son significativamente más sensibles que los sistemas estándar de disco giratorio. Yokogawa Electric inventó esta tecnología en 1992. [ 5 ]

Los microscopios de matriz programable (PAM) utilizan un modulador espacial de luz (SLM) controlado electrónicamente que genera un conjunto de orificios móviles. El SLM es un dispositivo que contiene una matriz de píxeles con alguna propiedad ( opacidad , reflectividad o rotación óptica ) que se puede ajustar electrónicamente. El SLM contiene espejos microelectromecánicos o componentes de cristal líquido . La imagen se suele capturar mediante una cámara CCD ( dispositivo de carga acoplada ).

Cada una de estas clases de microscopios confocales tiene ventajas y desventajas particulares. La mayoría de los sistemas están optimizados para la velocidad de grabación (es decir, captura de vídeo) o para una alta resolución espacial. Los microscopios confocales de barrido láser pueden tener una densidad de muestreo programable y resoluciones muy altas, mientras que los sistemas Nipkow y PAM utilizan una densidad de muestreo fija definida por la resolución de la cámara. Las velocidades de fotogramas de imagen suelen ser más lentas para los sistemas de barrido láser de un solo punto que para los sistemas de disco giratorio o PAM. Los microscopios confocales comerciales de disco giratorio alcanzan velocidades de fotogramas de más de 50 por segundo [ 6 ] , una característica deseable para observaciones dinámicas como la obtención de imágenes de células vivas.

El desarrollo vanguardista de la microscopía confocal de barrido láser permite ahora obtener imágenes a una velocidad superior a la del vídeo estándar (60 fotogramas por segundo) mediante el uso de múltiples espejos de barrido microelectromecánicos.

La imagen de fluorescencia de rayos X confocal es una técnica más reciente que permite controlar la profundidad, además de la orientación horizontal y vertical, por ejemplo, al analizar capas ocultas en una pintura. [ 7 ]

Mejora de la resolución

La microscopía confocal láser (CLSM) es una técnica de imagen por barrido cuya resolución se explica mejor comparándola con otra técnica de barrido, como la del microscopio electrónico de barrido (SEM). La CLSM tiene la ventaja de no requerir que la sonda esté suspendida a nanómetros de la superficie, como en un microscopio de fuerza atómica (AFM) o un microscopio de efecto túnel (STM) , por ejemplo, donde la imagen se obtiene mediante el barrido con una punta fina sobre la superficie. La distancia entre la lente del objetivo y la superficie (denominada distancia de trabajo ) suele ser comparable a la de un microscopio óptico convencional. Varía según el diseño óptico del sistema, pero las distancias de trabajo típicas oscilan entre cientos de micrómetros y varios milímetros.

En la microscopía confocal de barrido láser (CLSM), una muestra se ilumina con una fuente láser puntual, y cada elemento de volumen se asocia con una intensidad de dispersión o fluorescencia discreta. El tamaño del volumen de barrido viene determinado por el tamaño del punto (cercano al límite de difracción ) del sistema óptico, ya que la imagen del láser de barrido no es un punto infinitesimal, sino un patrón de difracción tridimensional. El tamaño de este patrón de difracción y el volumen focal que define se controlan mediante la apertura numérica del objetivo del sistema y la longitud de onda del láser utilizado. Esto se puede considerar como el límite de resolución clásico de los microscopios ópticos convencionales que utilizan iluminación de campo amplio. Sin embargo, con la microscopía confocal es posible incluso mejorar el límite de resolución de las técnicas de iluminación de campo amplio, ya que la apertura confocal se puede cerrar para eliminar los órdenes superiores del patrón de difracción . Por ejemplo, si el diámetro del orificio se ajusta a 1 unidad Airy , solo el primer orden del patrón de difracción atraviesa la apertura hasta el detector, mientras que los órdenes superiores se bloquean, mejorando así la resolución a costa de una ligera disminución del brillo. En las observaciones de fluorescencia, el límite de resolución de la microscopía confocal suele estar limitado por la relación señal-ruido causada por el pequeño número de fotones disponibles en este tipo de microscopía. Este efecto puede compensarse utilizando fotodetectores más sensibles o aumentando la intensidad de la fuente láser puntual de iluminación. Sin embargo, aumentar la intensidad del láser de iluminación conlleva el riesgo de un blanqueamiento excesivo u otros daños a la muestra, especialmente en experimentos donde se requiere comparar el brillo de la fluorescencia. Al obtener imágenes de tejidos con refracción diferencial, como el mesófilo esponjoso de las hojas de las plantas u otros tejidos con espacios aéreos, las aberraciones esféricas que perjudican la calidad de la imagen confocal suelen ser pronunciadas. No obstante, estas aberraciones pueden reducirse significativamente montando las muestras en perfluorocarbonos ópticamente transparentes y no tóxicos, como la perfluorodecalina , que se infiltra fácilmente en los tejidos y tiene un índice de refracción casi idéntico al del agua. [ 8 ] Al obtener imágenes en una geometría de reflexión, también es posible detectar la interferencia de la luz reflejada y dispersa de un objeto como un orgánulo intracelular. La naturaleza interferométrica de la señal permite reducir el diámetro del orificio a 0,2 unidades de Airy y, por lo tanto, posibilita una mejora de resolución ideal de √2 sin sacrificar la relación señal-ruido como en la microscopía de fluorescencia confocal. [ 9 ]

Usos

La microscopía confocal de barrido láser (CLSM) se utiliza ampliamente en diversas disciplinas de las ciencias biológicas , desde la biología celular y la genética hasta la microbiología y la biología del desarrollo . [ 10 ] También se utiliza en óptica cuántica e imágenes y espectroscopia de nanocristales.

Biología y medicina

Ejemplo de una serie de imágenes de microscopio confocal que muestran la distribución de los filamentos de actina en toda la célula.

Clínicamente, la CLSM se utiliza en la evaluación de diversas enfermedades oculares y es particularmente útil para la obtención de imágenes, el análisis cualitativo y la cuantificación de las células endoteliales de la córnea . [ 11 ] Se utiliza para localizar e identificar la presencia de elementos fúngicos filamentosos en el estroma corneal en casos de queratomicosis , lo que permite un diagnóstico rápido y, por lo tanto, la instauración temprana de la terapia definitiva. La investigación sobre técnicas de CLSM para procedimientos endoscópicos ( endomicroscopía ) también se muestra prometedora. [ 12 ] En la industria farmacéutica, se recomendó seguir el proceso de fabricación de formas farmacéuticas de película delgada para controlar la calidad y la uniformidad de la distribución del fármaco. [ 13 ] La microscopía confocal también se utiliza para estudiar biopelículas , estructuras porosas complejas que son el hábitat preferido de los microorganismos. Algunas de las funciones temporales y espaciales de las biopelículas solo pueden entenderse estudiando su estructura a micro y mesoescalas. El estudio a microescala es necesario para detectar la actividad y la organización de microorganismos individuales. [ 14 ]

Óptica y cristalografía

La microscopía confocal de barrido láser (CLSM) se utiliza como mecanismo de recuperación de datos en algunos sistemas de almacenamiento óptico de datos 3D y ha ayudado a determinar la antigüedad del papiro de Magdalena .

Preservación de audio

El sistema IRENE utiliza microscopía confocal para el escaneo óptico y la recuperación de audio histórico dañado. [ 15 ] Los cilindros de cera de los fonógrafos se degradan inherentemente debido al contacto con la aguja cuando se reproducen según lo previsto; [ 16 ] la microscopía no requiere contacto y a menudo proporciona un mejor sonido que la reproducción con aguja. [ 17 ]

Caracterización de la superficie del material

Los microscopios confocales de barrido láser se utilizan para caracterizar la superficie de materiales microestructurados, como las obleas de silicio empleadas en la producción de células solares . Durante las primeras etapas del proceso, las obleas se graban químicamente en húmedo con compuestos ácidos o alcalinos, lo que les confiere una textura superficial. Posteriormente, se utiliza la microscopía confocal láser para observar el estado de la superficie resultante a nivel micrométrico. Esta técnica también permite analizar el grosor y la altura de las capas de metalización impresas sobre las células solares.

Variantes y mejoras

Mejorar la resolución axial

La función de dispersión puntual del orificio estenopeico es un elipsoide, varias veces más largo que ancho. Esto limita la resolución axial del microscopio. Una técnica para superar esta limitación es la microscopía 4Pi, donde se permite que la luz incidente y/o emitida interfiera tanto desde arriba como desde abajo de la muestra para reducir el volumen del elipsoide. Una técnica alternativa es la microscopía confocal theta . En esta técnica, el cono de luz de iluminación y la luz detectada forman un ángulo entre sí (se obtienen mejores resultados cuando son perpendiculares). La intersección de las dos funciones de dispersión puntual proporciona un volumen efectivo de muestra mucho menor. De esto surgió el microscopio de iluminación de plano único . Además, se puede emplear la deconvolución utilizando una función de dispersión puntual derivada experimentalmente para eliminar la luz desenfocada, mejorando el contraste tanto en el plano axial como en el lateral.

Súper resolución

Existen variantes confocales que alcanzan una resolución inferior al límite de difracción, como la microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED). Además de esta técnica, se dispone de una amplia variedad de otras técnicas de superresolución (no confocales), como PALM, (d)STORM , SIM, etc. Todas ellas presentan ventajas como la facilidad de uso, la resolución y la necesidad de equipos, tampones o fluoróforos especiales.

Funcionamiento a bajas temperaturas

Para obtener imágenes de muestras a bajas temperaturas, se han utilizado dos enfoques principales, ambos basados ​​en la arquitectura de la microscopía confocal de barrido láser . Un enfoque consiste en utilizar un criostato de flujo continuo : solo la muestra se encuentra a baja temperatura y se la aborda ópticamente a través de una ventana transparente. [ 18 ] Otro enfoque posible consiste en tener parte de la óptica (especialmente el objetivo del microscopio) en un dewar de almacenamiento criogénico . [ 19 ] Este segundo enfoque, aunque más engorroso, garantiza una mejor estabilidad mecánica y evita las pérdidas debidas a la ventana.

Interacción molecular

Para estudiar las interacciones moleculares mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM), se puede utilizar la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) para confirmar que dos proteínas se encuentran a una cierta distancia entre sí.

Imágenes

Historia

Los comienzos: 1940–1957

Esquema de la solicitud de patente de Minsky que muestra el principio del microscopio de barrido confocal por transmisión que construyó.

En 1940, Hans Goldmann, oftalmólogo en Berna , Suiza, desarrolló un sistema de lámpara de hendidura para documentar exámenes oculares. [ 20 ] Algunos autores posteriores consideran este sistema como el primer sistema óptico confocal. [ 21 ] [ 22 ]

En 1943, Zyun Koana publicó un sistema confocal. [ 23 ] [ 21 ]

En 1951, Hiroto Naora, colega de Koana, describió un microscopio confocal en la revista Science para espectrofotometría . [ 24 ]

El primer microscopio de barrido confocal fue construido por Marvin Minsky en 1955 y se solicitó una patente en 1957. El barrido del punto de iluminación en el plano focal se lograba moviendo la platina. No se presentó ninguna publicación científica ni se conservaron imágenes tomadas con él. [ 2 ] [ 25 ]

El microscopio de barrido en tándem

Esquema del microscopio de barrido en tándem de Petráň. Se ha añadido una barra roja para indicar el disco de Nipkow.

En la década de 1960, el checoslovaco Mojmír Petráň, de la Facultad de Medicina de la Universidad Carolina de Plzeň, desarrolló el microscopio de barrido en tándem, el primer microscopio confocal comercializado. Fue vendido por una pequeña empresa en Checoslovaquia y en Estados Unidos por Tracor-Northern (más tarde Noran), y utilizaba un disco Nipkow giratorio para generar múltiples orificios de excitación y emisión. [ 22 ] [ 26 ]

La patente checoslovaca fue presentada en 1966 por Petráň y Milan Hadravský, un colaborador checoslovaco. Una primera publicación científica con datos e imágenes generadas con este microscopio se publicó en la revista Science en 1967, con M. David Egger de la Universidad de Yale y Petráň como autores. [ 27 ] Como nota al pie de página de este artículo, se menciona que Petráň diseñó el microscopio y supervisó su construcción, y que era, en parte, "investigador asociado" en Yale. Una segunda publicación de 1968 describió la teoría y los detalles técnicos del instrumento y contó con Hadravský y Robert Galambos , jefe del grupo en Yale, como autores adicionales. [ 28 ] En 1970 se concedió la patente estadounidense. Fue presentada en 1967. [ 29 ]

1969: El primer microscopio confocal de barrido láser.

En 1969 y 1971, M. David Egger y Paul Davidovits de la Universidad de Yale publicaron dos artículos que describían el primer microscopio confocal de barrido láser . [ 30 ] [ 31 ] Era un escáner puntual, lo que significa que solo se generaba un punto de iluminación. Utilizaba microscopía de epi-iluminación-reflexión para la observación de tejido nervioso. Un  láser de helio-neón de 5 mW con  luz de 633 nm se reflejaba en un espejo semitransparente hacia el objetivo. El objetivo era una lente simple con una distancia focal de 8,5  mm. A diferencia de todos los sistemas anteriores y la mayoría de los posteriores, la muestra se escaneaba mediante el movimiento de esta lente (escaneo del objetivo), lo que provocaba un movimiento del punto focal. La luz reflejada volvía al espejo semitransparente, la parte transmitida se enfocaba mediante otra lente en el orificio de detección detrás del cual se colocaba un tubo fotomultiplicador. La señal se visualizaba mediante un tubo de rayos catódicos de un osciloscopio, y el rayo catódico se movía simultáneamente con el objetivo. Un dispositivo especial permitía realizar fotografías Polaroid , tres de las cuales se mostraron en la publicación de 1971.

Los autores especulan sobre los colorantes fluorescentes para investigaciones in vivo . Citan la patente de Minsky, agradecen a Steve Baer, ​​entonces estudiante de doctorado en la Facultad de Medicina Albert Einstein de Nueva York, donde desarrolló un microscopio confocal de barrido lineal, [ 32 ] por sugerir el uso de un láser con el "microscopio de Minsky" y agradecen a Galambos, Hadravsky y Petráň por las discusiones que llevaron al desarrollo de su microscopio. La motivación para su desarrollo fue que en el microscopio de barrido en tándem solo una fracción de 10⁻⁷ de la luz de iluminación participa en la generación de la imagen en el ocular. Por lo tanto, la calidad de la imagen no era suficiente para la mayoría de las investigaciones biológicas. [ 21 ] [ 33 ]

1977–1985: Escáneres puntuales con láser y escaneo de platina

En 1977, Colin JR Sheppard y Amarjyoti Choudhury , de Oxford , Reino Unido, publicaron un análisis teórico de los microscopios confocales y de barrido láser. [ 34 ] Probablemente sea la primera publicación que utiliza el término "microscopio confocal". [ 21 ] [ 33 ]

En 1978, los hermanos Christoph Cremer y Thomas Cremer publicaron un diseño para un microscopio confocal de barrido láser que utilizaba excitación fluorescente con autoenfoque electrónico. También propusieron una iluminación puntual láser mediante un " holograma de 4π puntos ". [ 33 ] [ 35 ] Este diseño de CLSM combinó por primera vez el método de barrido láser con la detección 3D de objetos biológicos marcados con marcadores fluorescentes .

En 1978 y 1980, el grupo de Oxford liderado por Colin Sheppard y Tony Wilson describió un microscopio confocal con iluminación láser epifluorescente, escaneo de platina y tubos fotomultiplicadores como detectores. La platina podía moverse a lo largo del eje óptico (eje z), lo que permitía realizar cortes seriados ópticos. [ 33 ]

En 1979, Fred Brakenhoff y sus colaboradores demostraron que las ventajas teóricas del seccionamiento óptico y la mejora de la resolución eran, en efecto, alcanzables en la práctica. En 1985, este grupo fue el primero en publicar imágenes convincentes, obtenidas con un microscopio confocal, que permitieron responder preguntas biológicas. [ 36 ] Poco después, muchos otros grupos comenzaron a utilizar la microscopía confocal para responder preguntas científicas que hasta entonces habían permanecido sin respuesta debido a limitaciones tecnológicas.

En 1983, I.J. Cox y C. Sheppard, de Oxford, publicaron el primer trabajo en el que un microscopio confocal fue controlado por una computadora. El primer microscopio de escaneo láser comercial, el escáner de platina SOM-25, fue ofrecido por Oxford Optoelectronics (tras varias adquisiciones por parte de BioRad) a partir de 1982. Se basó en el diseño del grupo de Oxford. [ 22 ] [ 37 ]

A partir de 1985: Escáneres láser puntuales con escaneo de haz.

A mediados de la década de 1980, William Bradshaw Amos , John Graham White y sus colegas del Laboratorio de Biología Molecular de Cambridge construyeron el primer microscopio confocal de barrido de haz. [ 38 ] [ 39 ] La platina con la muestra no se movía, sino que lo hacía el punto de iluminación, lo que permitía una adquisición de imágenes más rápida: cuatro imágenes por segundo con 512 líneas cada una. Las imágenes intermedias enormemente magnificadas, gracias a una trayectoria del haz de 1 a 2 metros de longitud, permitieron el uso de un diafragma de iris convencional como un "agujero estenopeico", con diámetros de ~1  mm. Las primeras micrografías se tomaron con una exposición prolongada en película antes de que se añadiera una cámara digital. Una mejora posterior permitió ampliar la preparación por primera vez. Zeiss , Leitz y Cambridge Instruments no tenían interés en una producción comercial. [ 40 ] El Consejo de Investigación Médica (MRC) finalmente patrocinó el desarrollo de un prototipo. El diseño fue adquirido por Bio-Rad , modificado con control informático y comercializado como "MRC 500". El modelo sucesor, el MRC 600, sirvió posteriormente de base para el desarrollo del primer microscopio de fluorescencia de dos fotones desarrollado en 1990 en la Universidad de Cornell . [ 36 ]

Los avances en el Instituto Real de Tecnología KTH de Estocolmo , aproximadamente en la misma época, dieron lugar a un CLSM comercial distribuido por la empresa sueca Sarastro. [ 41 ] La empresa fue adquirida en 1990 por Molecular Dynamics, [ 42 ] pero el CLSM finalmente se descontinuó. En Alemania, Heidelberg Instruments , fundada en 1984, desarrolló un CLSM, que inicialmente estaba destinado a aplicaciones industriales en lugar de biológicas. Este instrumento fue adquirido en 1990 por Leica Lasertechnik . Zeiss ya tenía en el mercado un microscopio de escaneo láser de punto móvil no confocal que fue actualizado a confocal. Un informe de 1990, [ 43 ] mencionó algunos fabricantes de confocales: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Northern y Zeiss. [ 36 ]

En 1989, Fritz Karl Preikschat , junto con su hijo Ekhard Preikschat, inventó el microscopio de diodo láser de barrido para el análisis del tamaño de partículas. [ 44 ] [ 45 ] y cofundó Lasentec para su comercialización. En 2001, Lasentec fue adquirida por Mettler Toledo . [ 46 ] Se utilizan principalmente en la industria farmacéutica para proporcionar control in situ del proceso de cristalización en grandes sistemas de purificación.

Década de 2010: Métodos computacionales para eliminar el orificio de salida

En los microscopios confocales estándar, el segundo orificio, o orificio de salida, se utiliza para filtrar la luz emitida o dispersa. Tradicionalmente, este orificio es un componente pasivo que bloquea la luz para filtrar la iluminación ópticamente. Sin embargo, los diseños más recientes buscan realizar este filtrado digitalmente.

Los enfoques recientes han reemplazado el orificio pasivo con un elemento detector compuesto. Por lo general, después del procesamiento digital, este enfoque conduce a una mejor resolución y presupuesto de fotones, ya que el límite de resolución puede aproximarse al de un orificio infinitamente pequeño. [ 47 ]

Otros investigadores han intentado reenfocar digitalmente la luz de una fuente de excitación puntual utilizando redes neuronales convolucionales profundas. [ 48 ]

Véase también

Referencias

  1. 1 2 Pawley JB, ed. (2006). Manual de microscopía confocal biológica (3.ª  ed.). Berlín: Springer. ISBN 0-387-25921-X.
  2. 1 2 US 3013467 , Minsky, Marvin, "Aparato de microscopía", publicado el 19 de diciembre de 1961 
  3. ↑ Memorias sobre la invención del microscopio de barrido confocal , Scanning 10 (1988), pp. 128-138.
  4. 1 2 Fellers TJ, Davidson MW (2007). "Introducción a la microscopía confocal" . Centro de recursos Olympus Fluoview . Laboratorio Nacional de Altos Campos Magnéticos . Recuperado el 25 de julio de 2007 .
  5. ↑ US 5162941 , Favro, Lawrence D.; Thomas, Robert L. y Kuo, Pao-Kuang et al., "Microscopio confocal", publicado el 10 de noviembre de 1992, asignado a la Junta de Gobernadores de la Universidad Estatal de Wayne. 
  6. ↑ "Hoja de datos del microscopio confocal de luz blanca de disco giratorio NanoFocus µsurf " . Archivado del original el 20 de enero de 2014. Consultado el 14 de agosto de 2013 .
  7. ↑ Vincze L (2005). "Imágenes de fluorescencia de rayos X confocales y tomografía XRF para microanálisis tridimensional de elementos traza" . Microscopía y microanálisis . 11 (Suplemento 2). doi : 10.1017/S1431927605503167 .
  8. ↑ Littlejohn, George R.; Gouveia, João D.; Edner, Christoph; Smirnoff, Nicholas; Love, John (2010). "La perfluorodecalina mejora la resolución de la microscopía confocal in vivo del mesófilo de Arabidopsis thaliana". New Phytologist . 186 (4): 1018– 1025. Bibcode : 2010NewPh.186.1018L . doi : 10.1111/j.1469-8137.2010.03244.x . hdl : 10026.1/9344 . ISSN 1469-8137 . PMID 20374500 .  
  9. ↑ Küppers, Michelle; Albrecht, David; Kashkanova, Anna D.; Lühr, Jennifer; Sandoghdar, Vahid (7 de abril de 2023). " La microscopía de dispersión interferométrica confocal revela la estructura y dinámica nanoscópica 3D en células vivas" . Nature Communications . 14 (1): 1962. Bibcode : 2023NatCo..14.1962K . doi : 10.1038/s41467-023-37497-7 . ISSN 2041-1723 . PMC 10081331. PMID 37029107 .   
  10. ↑ Juan Carlos Stockert, Alfonso Blázquez-Castro (2017). «Capítulo 6. Instrumentación y técnicas de fluorescencia» . Microscopía de fluorescencia en ciencias de la vida . Bentham Science Publishers. pp. 180–184 . ISBN  978-1-68108-519-7Archivado del original el 14 de mayo de 2019. Consultado el 24 de diciembre de 2017 .
  11. ↑ Patel DV, McGhee CN (2007). "Microscopía confocal in vivo contemporánea de la córnea humana viva utilizando luz blanca y técnicas de escaneo láser: una revisión importante". Clin . Experiment. Ophthalmol . 35 (1): 71– 88. doi : 10.1111/j.1442-9071.2007.01423.x . PMID 17300580. S2CID 23029612 .  
  12. ↑ Hoffman A, Goetz M, Vieth M, Galle PR, Neurath MF, Kiesslich R (2006). "Endomicroscopía láser confocal: estado técnico e indicaciones actuales". Endoscopy . 38 ( 12): 1275– 83. doi : 10.1055/s-2006-944813 . PMID 17163333. S2CID 260134204 .  
  13. ↑ Le Person, S.; Puiggali, JR; Baron, M.; Roques, M. (1998). "Secado por infrarrojo cercano de películas delgadas farmacéuticas: Análisis experimental del transporte interno de masa" (PDF) . Chemical Engineering and Processing: Process Intensification . 37 (3): 257– 263. Bibcode : 1998CEPPI..37..257L . doi : 10.1016/S0255-2701(98)00032-4 .
  14. ↑ Gitis, Vitaly; Rothenberg, Gadi (2020). Gitis, Vitaly; Rothenberg, Gadi (eds.). Manual de materiales porosos . Singapur: World Scientific. pp. 63–64 . doi : 10.1142/11909 . ISBN  978-981-122-322-8.
  15. ↑ El proceso de digitalización . Proyecto IRENE, Bibliotecas de la Universidad de California, Berkeley .
  16. ↑ "Cuidado de cilindros, discos y cintas en pocas palabras" (PDF) . Archivado del original (PDF) el 4 de agosto de 2023.
  17. ↑ Fedeyev, Vitaliy; Haber, Carl ; Radding, Zachary; Maul, Christian; McBride, John; Golden, Mitchell (mayo de 2004). "Reconstrucción de sonido grabado mecánicamente mediante procesamiento de imágenes" (PDF) . Journal of the Acoustical Society of America . 115 (5): 172. Bibcode : 2001ASAJ..115.2494F . doi : 10.1121/1.4782907 . S2CID 7371031 . 
  18. ↑ Hirschfeld, V.; Hubner, CG (2010). "Un microscopio óptico confocal de barrido láser sensible y versátil para la fluorescencia de moléculas individuales a 77 K". Review of Scientific Instruments . 81 (11): 113705–113705–7. Bibcode : 2010RScI...81k3705H . ​​doi : 10.1063/1.3499260 . PMID 21133476 . 
  19. ↑ Grazioso, F.; Patton, BR; Smith, JM (2010). "Un microscopio óptico confocal de barrido de haz de alta estabilidad para operación a baja temperatura". Review of Scientific Instruments . 81 (9): 093705– 4. Bibcode : 2010RScI...81i3705G . doi : 10.1063/1.3484140 . PMID 20886985 . 
  20. ↑ Hans Goldman (1939). "Spaltlampenphotographie und –photometrie". Oftalmológica . 98 (5/6): 257– 270. doi : 10.1159/000299716 .Nota: El volumen 98 corresponde al año 1939; sin embargo, en la primera página del artículo figura enero de 1940 como fecha de publicación.
  21. 1 2 3 4 Colin JR Sheppard (3 de noviembre de 2009). "Microscopía confocal. El desarrollo de una microscopía moderna". Imaging & Microscopy .en línea
  22. 1 2 3 Barry R. Masters: Microscopía confocal y microscopía de excitación multifotónica. Los orígenes de la obtención de imágenes de células vivas. SPIE Press, Bellingham, Washington, EE. UU., 2006, ISBN 978-0-8194-6118-6, págs. 120–121.
  23. ↑ Zyun Koana (1942). Revista del Instituto de Ingeniería de Iluminación . 26 (8): 371– 385.{{cite journal}}: Falta o está vacío |title=( ayuda ) El artículo está disponible en el sitio web de la revista . El archivo pdf etiquetado como "P359 - 402" tiene un tamaño de 19 020 kilobytes y también contiene artículos adyacentes del mismo número. La figura 1b del artículo muestra el esquema de la trayectoria de un haz de transmisión confocal.
  24. ↑ Naora, Hiroto (1951). "Microespectrofotometría y análisis citoquímico de ácidos nucleicos". Science . 114 (2959): 279– 280. Bibcode : 1951Sci...114..279N . doi : 10.1126/science.114.2959.279 . PMID 14866220 . 
  25. ↑ Marvin Minsky (1988). "Memorias sobre la invención del microscopio de barrido confocal". Scanning . 10 (4): 128– 138. doi : 10.1002/sca.4950100403 .
  26. ↑ Guy Cox: Técnicas de imagen óptica en biología celular. 1.ª edición. CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, EE. UU., 2006, ISBN 0-8493-3919-7páginas 115–122.
  27. ↑ Egger MD, Petrăn M (julio de 1967). "Nuevo microscopio de luz reflejada para la visualización de células cerebrales y ganglionares sin teñir". Science . 157 (786): 305– 7. Bibcode : 1967Sci...157..305E . doi : 10.1126/science.157.3786.305 . PMID 6030094 . S2CID 180450 .  
  28. ↑ MOJMÍR PETRÁŇ; MILAN HADRAVSKÝ; M. DAVID EGGER; ROBERT GALAMBOS (1968). "Microscopio de luz reflejada de escaneo en tándem". Journal of the Optical Society of America . 58 (5): 661– 664. Bibcode : 1968JOSA...58..661P . doi : 10.1364/JOSA.58.000661 .
  29. ↑ US 3517980 , Petran, Mojmir y Hadravsky, Milán, "Método y disposición para mejorar el poder de resolución y el contraste", publicado el 30 de junio de 1970, asignado a Ceskoslovenska akadamie 
  30. ↑ Davidovits, P.; Egger, MD (1969). "Microscopio láser de barrido" . Nature . 223 ( 5208): 831. Bibcode : 1969Natur.223..831D . doi : 10.1038/223831a0 . PMID 5799022. S2CID 4161644 .  
  31. ↑ Davidovits, P.; Egger, MD (1971). "Microscopio láser de barrido para investigaciones biológicas". Applied Optics . 10 (7): 1615– 1619. Bibcode : 1971ApOpt..10.1615D . doi : 10.1364/AO.10.001615 . PMID 20111173 . 
  32. ↑ Barry R. Masters: Microscopía confocal y microscopía de excitación multifotónica. Los orígenes de la obtención de imágenes de células vivas. SPIE Press, Bellingham, Washington, EE. UU., 2006, ISBN 978-0-8194-6118-6, págs. 124–125.
  33. 1 2 3 4 Shinya Inoué (2006). «Capítulo 1: Fundamentos de la imagen de barrido confocal en microscopía óptica». En James Pawley (ed.). Manual de microscopía confocal biológica (3.ª ed.). Springer Science and Business Media LLC. págs. 1-19 . ISBN   978-0-387-25921-5.
  34. ↑ Sheppard, CJR; Choudhury, A. (1977). "Formación de imágenes en el microscopio de barrido". Optica Acta: Revista internacional de óptica . 24 (10): 1051– 1073. Bibcode : 1977AcOpt..24.1051S . doi : 10.1080/713819421 .
  35. ↑ Cremer, C.; Cremer, T. (1978). "Consideraciones sobre un microscopio de barrido láser con alta resolución y profundidad de campo". Microscopica Acta . 81 (1): 31– 44. PMID 713859 . 
  36. 1 2 3 Amos, WB ; White, JG (2003). "Cómo el microscopio de barrido láser confocal entró en la investigación biológica" . Biology of the Cell . 95 (6): 335– 342. doi : 10.1016/S0248-4900(03)00078-9 . PMID 14519550 . S2CID 34919506 .  
  37. ↑ Cox, IJ; Sheppard, CJ (1983). "Microscopio óptico de barrido que incorpora un almacenamiento de fotogramas digital y un microordenador". Applied Optics . 22 (10): 1474. Bibcode : 1983ApOpt..22.1474C . doi : 10.1364/ao.22.001474 . PMID 18195988 . 
  38. ↑ White, JG (1987). "Una evaluación de la obtención de imágenes confocales versus convencionales de estructuras biológicas mediante microscopía de luz de fluorescencia" . The Journal of Cell Biology . 105 (1): 41– 48. doi : 10.1083/jcb.105.1.41 . ISSN 0021-9525 . PMC 2114888. PMID 3112165 .   
  39. ↑ Anónimo (2005). "Dr. John White FRS" . royalsociety.org . Londres: Royal Society . Archivado del original el 17 de noviembre de 2015.
  40. ↑ Amos, WB; White, JG (2003). "Cómo el microscopio confocal de barrido láser entró en la investigación biológica" . Biology of the Cell . 95 (6): 335– 342. doi : 10.1016/S0248-4900(03)00078-9 . PMID 14519550. S2CID 34919506 .  
  41. ↑ Carlsson, K.; Danielsson, PE; Lenz, R.; Liljeborg, A.; Majlöf, L.; Åslund, N. (1985). "Microscopía tridimensional mediante un microscopio confocal de barrido láser". Optics Letters . 10 (2): 53– 55. Bibcode : 1985OptL...10...53C . doi : 10.1364/OL.10.000053 . PMID 19724343 . 
  42. ↑ Brent Johnson (1 de febrero de 1999). "La imagen lo es todo". The Scientist .en línea
  43. ↑ Diana Morgan (23 de julio de 1990). "Los microscopios confocales amplían los horizontes profesionales en biología celular". The Scientist .en línea
  44. ↑ US 4871251 , Preikschat, Fritz K. y Preikschat, Ekhard, "Aparato y método para el análisis de partículas", publicado el 3 de octubre de 1989. 
  45. ↑ US 5012118 , Preikschat, Fritz K. y Preikschat, Ekhard, "Aparato y método para el análisis de partículas", publicado el 30 de abril de 1991 
  46. ↑ Reservados todos los derechos, Mettler-Toledo International Inc. "Análisis de distribución del tamaño de partícula" . Archivado del original el 9 de octubre de 2016. Consultado el 6 de octubre de 2016 .
  47. ↑ Weisshart, Klaus. "El principio básico del escaneo Airyscanning" (PDF) . pages.zeiss.com . Consultado el 13 de noviembre de 2025 .
  48. ↑ Xi, Chen; Mikhail, Kandel; Shenghua, He; Chenfei, Hu; Young Jae, Lee; Kathryn, Sullivan; Gregory, Tracy; Hee Jung, Chung; Hyun Joon, Kong; Mark, Anastasio; Gabriel, Popescu (2023). "Microscopía confocal artificial para imágenes profundas sin etiquetas" . Nature Photonics . 17 (3): 250– 258. arXiv : 2110.14823 . Bibcode : 2023NaPho..17..250C . doi : 10.1038/ s41566-022-01140-6 . PMC 10153546. PMID 37143962 .  
  49. ↑ Aunque utilizan una tecnología relacionada (ambos son microscopios de escaneo láser), los microscopios de fluorescencia multifotónica no son estrictamente microscopios confocales; el término confocal surge de la presencia de un diafragma en el plano focal conjugado (confocal) que generalmente está ausente en los microscopios multifotónicos debido a las dificultades para desescanear el haz.
  • Hoffman, David P.; Shtengel, Gleb; Xu, C. Shan; Campbell, Kirby R.; Freeman, Melanie; Wang, Lei; Milkie, Daniel E.; Pasolli, H. Amalia; Iyer, Nirmala; Bogovic, John A.; Stabley, Daniel R.; Shirinifard, Abbas; Pang, Song; Peale, David; Schaefer, Kathy; Pomp, Wim; Chang, Chi-Lun; Lippincott-Schwartz, Jennifer; Kirchhausen, Tom; Solecki, David J.; Betzig, Eric; Hess, Harald F. (2020). "Microscopía electrónica correlativa tridimensional de superresolución y de superficie de bloque de células congeladas vítreamente" . Science . 367 (6475) eaaz5357. doi : 10.1126/science.aaz5357 . ISSN 0036-8075 . PMC 7339343 . PMID 31949053 .   
  • CLSM virtual (basado en Java)
  • Animaciones y explicaciones sobre diversos tipos de microscopios, incluidos los microscopios de fluorescencia y confocales (Université Paris Sud).
  • Las piezas necesitan saberlo.
Obtenido de " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Confocal_microscopy&oldid=1353003635 "
Lecturas relacionadas
6 articulos
Resolución ópticaResolución ópticaLa resolución óptica describe la capacidad de un sistema de imágenes para captar detalles del objeto que se está captando. Un sistema de imágenes p...Contraste (visión)Contraste (visión)El contraste es la diferencia de luminancia o color que hace que un objeto (o su representación en una imagen o pantalla) sea visible contra un fon...MicrografíaMicrografíaUna micrografía o fotomicrografía es una fotografía o imagen digital tomada a través de un microscopio o dispositivo similar para mostrar una image...Filtro espacialFiltro espacialUn filtro espacial es un dispositivo óptico que utiliza los principios de la óptica de Fourier para alterar la estructura de un haz de luz u otra r...Seccionamiento ópticoSeccionamiento ópticoEl corte óptico es el proceso mediante el cual un microscopio diseñado adecuadamente puede producir imágenes claras de los planos focales en las pr...iconoLista de ciencias de la vidaDiferentes tipos de criaturas vivientes estudiadas en las ciencias de la vida. Arriba: microorganismos ( bacteria E. coli ) y un animal ( escarabaj...