microscopio de fluorescencia de reflexión interna total

Un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total ( TIRFM ) es un tipo de microscopio con el que se puede observar una región delgada de una muestra, generalmente de menos de 200 nanómetros.

La microscopía de fluorescencia infrarroja térmica (TIRFM) es una técnica de imagen que utiliza la excitación de células fluorescentes en una sección delgada de muestra óptica sostenida sobre un portaobjetos de vidrio. La técnica se basa en el principio de que cuando la luz de excitación se refleja internamente de forma total en un cubreobjetos sólido transparente en su interfaz con un medio líquido, se genera un campo electromagnético, también conocido como onda evanescente, en la interfaz sólido-líquido con la misma frecuencia que la luz de excitación. ^{[ 1 ]} La intensidad de la onda evanescente decae exponencialmente con la distancia a la superficie del sólido, de modo que solo las moléculas fluorescentes situadas a unos pocos cientos de nanómetros del sólido se excitan eficazmente. De este modo, se pueden obtener imágenes bidimensionales de la fluorescencia, aunque también existen mecanismos que permiten obtener información tridimensional sobre la ubicación de vesículas o estructuras en las células. ^{[ 2 ]}

Historia

La fluorescencia de campo amplio se introdujo en 1910; se trataba de una técnica óptica que iluminaba toda la muestra. ^{[ 3 ]} Posteriormente, en 1960, se introdujo la microscopía confocal, que redujo el ruido de fondo y el tiempo de exposición de la muestra al dirigir la luz a un punto preciso e iluminar la muestra con conos de luz. En la década de 1980, la introducción de la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) redujo aún más el ruido de fondo y el tiempo de exposición al iluminar únicamente la sección delgada de la muestra examinada. ^{[ 3 ]}

Fondo

Existen dos métodos comunes para producir la onda evanescente para TIRFM. ^{[ 1 ]} El primero es el método del prisma, que utiliza un prisma para dirigir el láser hacia la interfaz entre el cubreobjetos y el medio/células con un ángulo de incidencia suficiente para causar reflexión interna total. Esta configuración se ha aplicado a la microscopía celular durante más de 30 años, pero nunca se ha convertido en una herramienta de uso generalizado debido a varias limitaciones. Aunque existen muchas variaciones de la configuración del prisma, la mayoría restringe el acceso a la muestra, lo que dificulta realizar manipulaciones, inyectar medios en el espacio de la muestra o llevar a cabo mediciones fisiológicas. ^{[ 2 ]} Otra desventaja es que, en la mayoría de las configuraciones basadas en diseños de microscopios invertidos, la iluminación se introduce en el lado de la muestra opuesto a la óptica del objetivo, lo que requiere la obtención de imágenes de la región del campo evanescente a través del volumen de la muestra. La gran complejidad y precisión requeridas para obtener imágenes de este sistema hicieron que el método del prisma no fuera utilizado por muchos biólogos, sino que se limitara su uso a los físicos.

El otro método se conoce como método de lente objetivo, que ha incrementado el uso de TIRFM en microscopía celular y se ha incrementado aún más desde que se ha comercializado una solución. ^{[ 2 ]} En este mecanismo, se puede alternar fácilmente entre la fluorescencia de campo amplio estándar y TIRF cambiando la posición fuera del eje del foco del haz en el plano focal posterior del objetivo. Existen varias formas desarrolladas para cambiar la posición del haz, como el uso de un actuador que puede cambiar la posición en relación con el iluminador de fluorescencia acoplado al microscopio.

Solicitud

En biología celular y molecular, se han estudiado numerosos eventos moleculares en superficies celulares, como la adhesión celular , la unión de hormonas a las células , la secreción de neurotransmisores y la dinámica de membranas, mediante microscopios de fluorescencia convencionales . Sin embargo, los fluoróforos unidos a la superficie de la muestra y los presentes en el medio circundante se encuentran en equilibrio . Al excitar y detectar estas moléculas con un microscopio de fluorescencia convencional, la fluorescencia resultante de los fluoróforos unidos a la superficie suele quedar enmascarada por la fluorescencia de fondo, debido a la mayor cantidad de moléculas no unidas. La microscopía de fluorescencia infrarroja térmica (TIRFM) permite la excitación selectiva de los fluoróforos unidos a la superficie, mientras que las moléculas no unidas no se excitan y, por lo tanto, no fluorescen. Gracias a su selectividad superficial submicrométrica, la TIRFM se ha convertido en un método de referencia para la detección de moléculas individuales.

La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) tiene numerosas aplicaciones en la microscopía celular. Algunas de estas aplicaciones incluyen:

Medición de la cinética de la endocitosis del receptor en respuesta a la unión del ligando y al movimiento del receptor.
Observación de eventos exocíticos mediante la carga de vesículas que experimentan exocitosis con colorantes fluorescentes.
Descripción cualitativa y cuantitativa de las funciones que desempeñan las diferentes proteínas en la endocitosis/exocitosis.
Observar el tamaño, el movimiento y la distancia entre las regiones de contacto entre una célula y un sustrato sólido.

Gracias a su capacidad para resolver vesículas individuales ópticamente y seguir directamente la dinámica de sus interacciones, la TIRFM permite estudiar la gran cantidad de proteínas implicadas en procesos neurobiológicos de una manera que antes no era posible. ^{[ 2 ]}

Beneficios

La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) ofrece varias ventajas sobre la microscopía de fluorescencia confocal y de campo amplio estándar, tales como:

El fondo se reduce sustancialmente para que las estructuras se puedan ver con claridad.
Prácticamente no se recoge fluorescencia desenfocada, lo que disminuye los efectos de desenfoque.
Las células están expuestas a una cantidad de luz significativamente menor, lo que limita la fototoxicidad para las células.

Descripción general

La idea de utilizar la reflexión interna total para iluminar células en contacto con la superficie del vidrio fue descrita por primera vez por E.J. Ambrose en 1956. ^{[ 4 ]} Esta idea fue posteriormente ampliada por Daniel Axelrod ^{[ 5 ]} en la Universidad de Michigan , Ann Arbor, a principios de la década de 1980, dando origen a la microscopía de reflexión interna total (TIRFM). La TIRFM utiliza una onda evanescente para iluminar y excitar selectivamente fluoróforos en una región restringida de la muestra, inmediatamente adyacente a la interfaz vidrio-agua. El campo electromagnético evanescente decae exponencialmente desde la interfaz, penetrando así hasta una profundidad de aproximadamente 100 nm en el medio de la muestra. De este modo, la TIRFM permite la visualización selectiva de regiones superficiales como la membrana plasmática basal (de unos 7,5 nm de espesor) de las células. Cabe señalar, sin embargo, que la región visualizada tiene al menos unos cientos de nanómetros de ancho, por lo que la zona citoplasmática inmediatamente debajo de la membrana plasmática se visualiza necesariamente, además de la propia membrana plasmática, durante la microscopía TIRF. La visualización selectiva de la membrana plasmática permite representar las características y los eventos que ocurren en la membrana plasmática de las células vivas con alta resolución axial .

La TIRF también se puede utilizar para observar la fluorescencia de una sola molécula , ^{[ 6 ]}^{[ 7 ]} lo que la convierte en una herramienta importante de la biofísica y la biología cuantitativa. La microscopía TIRF también se ha aplicado en la detección de moléculas individuales de biomarcadores de ADN y en la discriminación de SNP. ^{[ 8 ]}

Se ha demostrado que la geometría cis (TIRFM a través del objetivo) y la geometría trans (TIRFM basada en prismas y guías de luz) proporcionan una calidad diferente del efecto de reflexión interna total. En el caso de la geometría trans, la trayectoria de la luz de excitación y el canal de emisión están separados, mientras que en el caso de la TIRFM de tipo objetivo comparten el objetivo y otros elementos ópticos del microscopio. Se ha demostrado que la geometría basada en prismas genera una onda evanescente limpia, cuyo decaimiento exponencial se aproxima a la función predicha teóricamente. ^{[ 9 ]} Sin embargo, en el caso de la TIRFM basada en el objetivo, la onda evanescente está contaminada con luz parásita intensa . Se ha demostrado que la intensidad de la luz parásita asciende al 10-15% de la onda evanescente, lo que dificulta la interpretación de los datos obtenidos mediante la TIRFM de tipo objetivo. ^{[ 10 ]}^{[ 11 ]}

Mecanismo

Los componentes básicos de los dispositivos TIRFM se muestran en la figura de la derecha.

Basado en objetivos frente a basado en prismas.

Las principales diferencias entre la microscopía de fluorescencia infrarroja térmica (TIRFM) basada en objetivo (cis) y la basada en prisma (trans) radican en que la TIRFM basada en prisma requiere el uso de una interfaz prisma/solución para generar el campo evanescente, mientras que la TIRFM basada en objetivo no requiere prisma y utiliza una interfaz cubreobjetos/solución para generar dicho campo. Si bien la TIRFM basada en objetivo es la más utilizada, presenta una menor calidad de imagen debido al ruido de luz parásita presente en la onda evanescente.

Basado en prismas

Menor dispersión externa
Mucho más barato (cientos en lugar de miles de dólares)
Ideal para aumentos de rango medio-bajo y objetivos de inmersión en agua.
Más fácil con fuentes láser colimadas gratuitas
Mayor rango de ángulos de incidencia
- Deseable lograr la menor profundidad de campo evanescente.

Basado en objetivos

Gran aumento y apertura
Estable, fácil de configurar y alinear.
Funciona con fuentes láser colimadas libres, fibra óptica o fuentes de arco convencionales.

Metodología

Física fundamental

La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) se basa en el fenómeno óptico de la reflexión interna total , en el que las ondas que inciden en la interfaz de dos medios no se transmiten al medio 2, sino que se reflejan completamente de vuelta al medio 1. La reflexión interna total requiere que el medio 2 tenga un índice de refracción menor que el medio 1, y que las ondas incidan con ángulos suficientemente oblicuos en la interfaz. Un fenómeno observado que acompaña a la reflexión interna total es la onda evanescente , que se extiende espacialmente perpendicularmente desde la interfaz hacia el medio 2 y decae exponencialmente en función de la longitud de onda, el índice de refracción y el ángulo de incidencia. Es la onda evanescente la que se utiliza para lograr una mayor excitación de los fluoróforos cercanos a la superficie de la muestra y una menor excitación de los fluoróforos superfluos en la solución.

En la práctica, en la microscopía TIRF basada en objetivos, el medio 1 suele ser un cubreobjetos de vidrio con un índice de refracción alto, y el medio 2 es la muestra en solución con un índice de refracción menor. Puede haber aceite de inmersión entre la lente y el cubreobjetos de vidrio para evitar una refracción significativa a través del aire.

Onda evanescente

El ángulo crítico para la incidencia de luz excitatoria se puede derivar de la ley de Snell :

$\theta _{c}=\sin ^{-1}\left({\frac {n_{2}}{n_{1}}}\right)$

Para $n_{1}$ el índice de refracción de la muestra, $n_{2}$ el índice de refracción del cubreobjetos.

Así, a medida que el ángulo de incidencia alcanza $\theta _{c}$ , comenzamos a observar efectos de reflexión interna total y onda evanescente, y a medida que supera $\theta _{c}$ Estos efectos son más frecuentes.

La intensidad de la onda evanescente viene dada por:

$I(Z)=I_{0}e^{-z/d}$

Con profundidad de penetración $d$ dado por:

$d={\frac {\lambda _{0}}{4\pi }}\left(n_{2}^{2}\sin ^{2}\theta -n_{1}^{2}\right)^{-1/2}$

Típicamente, $d$ ≤~100 nanómetros, que es típicamente mucho más pequeño que la longitud de onda de la luz y mucho más delgado que una sección de microscopios confocales . ^{[ 1 ]}^{[ 12 ]}

Para la obtención de imágenes TIRFM, la longitud de onda del haz de excitación $\lambda _{0}$ Dentro de la muestra se puede seleccionar mediante filtrado. Además, el rango de ángulos de incidencia $\theta$ está determinado por la apertura numérica (AN) del objetivo y requiere que AN > $n$ . Este parámetro se puede ajustar cambiando el ángulo con el que el haz de excitación entra en la lente del objetivo. Finalmente, los índices de reflectancia ( $n$ ) de la solución y del cubreobjetos se pueden determinar experimentalmente o los fabricantes pueden informarlo.

haz de excitación

Para técnicas complejas de microscopía fluorescente, los láseres son la fuente de luz preferida debido a su alta uniformidad, intensidad y carácter casi monocromático. Sin embargo, cabe destacar que las fuentes de luz ARC LAMP y otros tipos de fuentes también pueden ser útiles. Generalmente, la longitud de onda del haz de excitación se determina según los requisitos de los fluoróforos presentes en la muestra, siendo las longitudes de onda de excitación más comunes en el rango de 400 a 700 nm para muestras biológicas.

En la práctica, una caja de luz genera un láser multicromático de alta intensidad, que luego se filtra para permitir el paso de las longitudes de onda deseadas y excitar la muestra. En la microscopía de fluorescencia infrarroja térmica (TIRFM) con objetivo, el haz de excitación y el haz de emisión fluorescente se capturan mediante la misma lente objetivo. Por lo tanto, para separar los haces, se utiliza un espejo dicromático que refleja el haz de excitación incidente hacia la lente objetivo y permite que el haz de emisión pase al detector. Puede ser necesario un filtrado adicional para separar aún más las longitudes de onda de emisión y excitación.

Haz de emisión

Al ser excitados con longitudes de onda específicas, los fluoróforos reemiten luz a longitudes de onda más largas (que contienen menos energía). En el contexto de la microscopía de fluorescencia infrarroja térmica (TIRFM), solo los fluoróforos cercanos a la interfaz se excitan fácilmente por el campo evanescente, mientras que aquellos que se encuentran más allá de los ~100 nm se atenúan considerablemente. La luz emitida por los fluoróforos no tiene una dirección definida y, por lo tanto, atraviesa la lente del objetivo en diferentes puntos con intensidades variables. Esta señal pasa luego a través del espejo dicromático y llega al detector.

Cubreobjetos y aceite de inmersión

Los cubreobjetos de vidrio suelen tener un índice de reflectancia alrededor de $n=1.52$ mientras que el índice de refracción del aceite de inmersión es comparable $n=1.51$ . El medio aire, que tiene un índice de refracción de $n=1.00$ Esto provocaría la refracción del haz de excitación entre el objetivo y el cubreobjetos, por lo que se utiliza aceite para amortiguar la región y evitar interacciones superfluas en la interfaz antes de que el haz alcance la interfaz entre el cubreobjetos y la muestra.

Lente objetivo

La apertura numérica (AN) del objetivo especifica el rango de ángulos en el que el sistema puede recibir o emitir luz.

Para lograr los mayores ángulos de incidencia, es deseable que la luz pase con un ángulo fuera del eje a través de la periferia de la lente.

Plano focal posterior (BPF)

El plano focal posterior (también llamado "plano de apertura") es el plano a través del cual se enfoca el haz excitatorio antes de pasar por el objetivo. Ajustar la distancia entre el objetivo y el filtro de paso de banda (BPF) puede generar diferentes aumentos de imagen, ya que el ángulo de incidencia se vuelve más o menos pronunciado. El haz debe pasar a través del BPF fuera del eje para que atraviese el objetivo en sus extremos, permitiendo que el ángulo sea suficientemente mayor que el ángulo crítico. El haz también debe enfocarse en el BPF porque esto asegura que la luz que pasa por el objetivo esté colimada, interactuando con el cubreobjetos en el mismo ángulo y, por lo tanto, reflejándose internamente por completo. ^{[ 12 ]}

Muestra

La muestra debe adsorberse sobre la superficie del cubreobjetos de vidrio y teñirse con los fluoróforos adecuados para visualizar las características deseadas. Este procedimiento se ajusta al de cualquier otra técnica de microscopía de fluorescencia .

Filtro dicromático

El filtro dicroico es un filtro de borde que se utiliza con un ángulo de incidencia oblicuo (típicamente 45°) para reflejar eficientemente la luz en la banda de excitación y transmitir la luz en la banda de emisión. El ángulo de 45° del filtro separa la trayectoria del haz de excitación y el haz de emisión. El filtro está compuesto por un sistema complejo de múltiples capas de metales, sales metálicas y dieléctricos que se han depositado al vacío sobre vidrio delgado. ^{[ 13 ]} Este recubrimiento está diseñado para tener una alta reflectividad para longitudes de onda más cortas y una alta transmisión para longitudes de onda más largas. ^{[ 14 ]} Mientras que el filtro transmite la luz de excitación seleccionada (longitud de onda más corta) a través del objetivo y hacia el plano de la muestra, también deja pasar la luz de fluorescencia de emisión (longitud de onda más larga) al filtro de barrera y refleja cualquier luz de excitación dispersa de vuelta hacia la fuente láser. ^{[ 15 ]} Esto maximiza la cantidad de radiación de excitación que pasa a través del filtro y el haz de fluorescencia emitido que es detectado por el detector. ^{[ 16 ]}

Filtro de barrera

El filtro de barrera bloquea principalmente las longitudes de onda no deseadas, especialmente las longitudes de onda de luz de excitación más cortas. Generalmente es un filtro de paso de banda que deja pasar solo las longitudes de onda emitidas por el fluoróforo y bloquea toda la luz no deseada fuera de esta banda. Los microscopios más modernos permiten cambiar el filtro de barrera según la longitud de onda de la emisión específica del fluoróforo. ^{[ 13 ]}

Detección y resolución de imágenes

La imagen es detectada por una cámara digital de dispositivo de carga acoplada (CCD). Las cámaras CCD tienen detectores de fotones, que son finas obleas de silicio, ensambladas en matrices bidimensionales de regiones sensibles a la luz. Las matrices de detectores capturan y almacenan información de la imagen en forma de carga eléctrica localizada que varía con la intensidad de la luz incidente. ^{[ 2 ]} Como se muestra en el esquema, los fotones se transforman en electrones por los detectores y los electrones se convierten en una señal eléctrica legible en la placa de circuito. ^{[ 17 ]} La señal eléctrica se convoluciona con una función de dispersión puntual (PSF) para muestrear la señal original. Por lo tanto, la resolución de la imagen depende en gran medida del número de detectores y la función de dispersión puntual determinará la resolución de la imagen. ^{[ 18 ]}

Artefactos y ruido en la imagen

La mayoría de las técnicas de imagen por fluorescencia presentan ruido de fondo debido a la iluminación y reconstrucción de grandes secciones (en el eje z) de las muestras. Dado que la microscopía de fluorescencia infrarroja térmica (TIRFM) utiliza una onda evanescente para fluorescer una sección delgada de la muestra, el ruido de fondo y los artefactos son inherentemente menores. Sin embargo, aún existen otros tipos de ruido y artefactos, como el ruido de Poisson, las aberraciones ópticas, el fotoblanqueo y la presencia de otras moléculas fluorescentes.

El ruido de Poisson representa incertidumbres fundamentales en la medición de la luz. Esto provoca incertidumbres durante la detección de fotones de fluorescencia. ^{[ 18 ]} Si se miden N fotones en una medición particular, existe una probabilidad del 63 % de que el valor promedio real se encuentre en el rango entre N +√N y N −√N. ^{[ 19 ]} Este ruido puede causar una representación errónea del objeto en ubicaciones de píxeles incorrectas.

Las aberraciones ópticas pueden surgir por la difracción de la luz de fluorescencia o por la desalineación del microscopio y el objetivo. La difracción de la luz en la muestra puede dispersar la señal de fluorescencia y provocar desenfoque en las imágenes convolucionadas. Del mismo modo, si existe una desalineación entre la lente del objetivo, el filtro y el detector, el haz de excitación o emisión puede no estar enfocado y causar desenfoque en las imágenes. ^{[ 14 ]}

El fotoblanqueo puede ocurrir cuando los enlaces covalentes o no covalentes de los fluoróforos se destruyen por la luz de excitación y dejan de fluorescer. ^{[ 20 ]} Las sustancias fluorescentes siempre se degradan en cierta medida por la energía de la radiación de excitación, lo que provoca que la fluorescencia se atenúe y dé como resultado una imagen oscura y borrosa. ^{[ 21 ]} El fotoblanqueo es inevitable, pero puede minimizarse evitando la exposición a la luz no deseada y utilizando aceites de inmersión para minimizar la dispersión de la luz. ^{[ 13 ]}

La autofluorescencia puede ocurrir en ciertas estructuras celulares donde el compuesto natural en la estructura fluorescería después de ser excitado a longitudes de onda relativamente más cortas (similares a la longitud de onda de excitación). ^{[ 18 ]} La fluorescencia inducida también puede ocurrir cuando ciertos compuestos no autofluorescentes se vuelven fluorescentes después de unirse a ciertas sustancias químicas (como el formaldehído). ^{[ 13 ]} Esta fluorescencia puede generar artefactos o ruido de fondo en la imagen. El ruido de otros compuestos fluorescentes puede eliminarse eficazmente utilizando filtros para capturar la longitud de onda de fluorescencia deseada, o asegurándose de que los compuestos autofluorescentes no estén presentes en la muestra.

Trabajo actual y futuro

Las técnicas modernas de fluorescencia intentan incorporar métodos para eliminar el desenfoque y el ruido. Las aberraciones ópticas suelen ser deterministas (es decir, son constantes durante todo el proceso de imagen y en diferentes muestras). ^{[ 18 ]} El desenfoque determinista se puede eliminar deconvolucionando la señal y restando el artefacto conocido. La técnica de deconvolución consiste simplemente en utilizar una transformada inversa de Fourier para obtener la señal de fluorescencia original y eliminar el artefacto. ^{[ 19 ]}

Sin embargo, se ha demostrado que la deconvolución solo funciona si hay una señal de fluorescencia fuerte o cuando el ruido se identifica claramente. Además, la deconvolución tiene un rendimiento deficiente porque no incluye información estadística y no puede reducir el ruido no determinista, como el ruido poissoniano. Para obtener una mejor resolución y calidad de imagen, los investigadores han utilizado técnicas estadísticas para modelar la probabilidad de que los fotones se distribuyan en el detector. ^{[ 18 ]}^{[ 22 ]} Esta técnica, denominada método de máxima verosimilitud , se está perfeccionando mediante algoritmos para mejorar su velocidad de procesamiento. ^{[ 22 ]}

Referencias

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Enlaces externos

Base de datos interactiva de tintes y filtros fluorescentes de Carl Zeiss.
Microscopía TIRF: Introducción y aplicaciones. Tutorial de TIRF de Microscopy U.
Microscopía TIRF: Introducción. Tutorial de TIRF del Centro de Recursos de Microscopía de Olympus.
Microscopios Olympus TIRFM Sistemas de microscopía TIRF comerciales
Sistemas de microscopio TIRF comerciales Carl Zeiss Laser TIRF 3
Microscopía TIRF basada en guías de luz y prismas TIRF-Labs.com: Microscopía y espectroscopía TIRF comerciales. Selección de la geometría TIRF para su aplicación.
Microscopía TIRF FLIM Lambert Instruments Microscopía TIRF - FLIM
Grupo de Investigación Schwartz, Grupo de Investigación de Imágenes de Moléculas Únicas de la Universidad de Colorado en Boulder

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