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microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Configuración básica de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz. La microscopía de fluorescencia de lámina de luz ( LSFM ) es una técnica de microscopía de fluorescenci...

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Configuración básica de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz.

La microscopía de fluorescencia de lámina de luz ( LSFM ) es una técnica de microscopía de fluorescencia con una resolución óptica intermedia a alta [ 1 ] , pero buenas capacidades de seccionamiento óptico y alta velocidad. A diferencia de la microscopía de epifluorescencia , solo se ilumina una sección delgada (generalmente de unos cientos de nanómetros a unos pocos micrómetros) de la muestra perpendicularmente a la dirección de observación. Para la iluminación, se utiliza una lámina de luz láser , es decir, un haz láser que se enfoca solo en una dirección (por ejemplo, usando una lente cilíndrica). Un segundo método utiliza un haz circular escaneado en una dirección para crear la lámina de luz. Como solo se ilumina la sección realmente observada, este método reduce el fotodaño y el estrés inducido en una muestra viva. Además, la buena capacidad de seccionamiento óptico reduce la señal de fondo y, por lo tanto, crea imágenes con mayor contraste, comparable a la microscopía confocal . Debido a que la microscopía de fluorescencia de lámina de luz escanea las muestras utilizando un plano de luz en lugar de un punto (como en la microscopía confocal), puede adquirir imágenes a velocidades entre 100 y 1000 veces superiores a las que ofrecen los métodos de escaneo puntual.

Comparación de diferentes modalidades de iluminación microscópica (LSFM: microscopía de fluorescencia de lámina de luz, WF: microscopía de campo amplio, CF: microscopía confocal). La microscopía de fluorescencia de lámina de luz combina un buen seccionamiento z (como la confocal) e ilumina solo el plano observado.

Este método se utiliza en biología celular [ 2 ] y para la microscopía de órganos, embriones y organismos intactos, a menudo aclarados químicamente. [ 3 ]

A partir de 1994, la microscopía de fluorescencia de lámina de luz se desarrolló como microscopía o tomografía de seccionamiento óptico de fluorescencia de plano ortogonal (OPFOS) [ 4 ] , principalmente para muestras grandes, y posteriormente como microscopía de iluminación de plano único/selectivo (SPIM), también con resolución subcelular. [ 5 ] Esto introdujo un esquema de iluminación en la microscopía de fluorescencia, que ya se ha utilizado con éxito para la microscopía de campo oscuro bajo el nombre de ultramicroscopía . [ 6 ]

Configuración

Configuración básica

Ilustración de diferentes implementaciones de microscopios de fluorescencia de lámina de luz. Véase el texto para más detalles. Leyenda: CAM=cámara, TL=lente del tubo, F=filtro, DO=objetivo de detección, S=muestra, SC=cámara de muestra, PO=objetivo de proyección, CL=lente cilíndrica, SM=espejo de escaneo

En este tipo de microscopía, [ 7 ] la iluminación se realiza perpendicularmente a la dirección de observación (véase la imagen esquemática en la parte superior del artículo). El haz expandido de un láser se enfoca en una sola dirección mediante una lente cilíndrica, o mediante una combinación de una lente cilíndrica y un objetivo de microscopio, ya que este último ofrece una mejor calidad óptica y una mayor apertura numérica que la primera. De esta forma, se crea una fina lámina de luz en la región focal que puede utilizarse para excitar la fluorescencia únicamente en una fina sección (generalmente de unos pocos micrómetros de espesor) de la muestra.

La luz de fluorescencia emitida por la lámina de luz se recoge perpendicularmente con un objetivo de microscopio estándar y se proyecta sobre un sensor de imagen (generalmente una cámara CCD , CCD de multiplicación de electrones o CMOS ). Para disponer de suficiente espacio para la óptica de excitación/lámina de luz, se utiliza un objetivo de observación con una gran distancia de trabajo. En la mayoría de los microscopios de fluorescencia de lámina de luz, el objetivo de detección y, a veces, también el de excitación, están completamente sumergidos en el tampón de muestra, por lo que normalmente la muestra y la óptica de excitación/detección se encuentran dentro de una cámara de muestra llena de tampón, que también puede utilizarse para controlar las condiciones ambientales (temperatura, nivel de dióxido de carbono, etc.) durante la medición. El montaje de la muestra en la microscopía de fluorescencia de lámina de luz se describe con más detalle a continuación.

Dado que tanto la lámina de luz de excitación como el plano focal de la óptica de detección deben coincidir para formar una imagen, no es posible enfocar diferentes partes de la muestra desplazando el objetivo de detección, sino que, por lo general, se desplaza y rota toda la muestra.

Extensiones de la idea básica

En los últimos años, se han desarrollado varias ampliaciones de este programa:

  • El uso de dos láminas de luz que se propagan en direcciones opuestas ayuda a reducir los artefactos típicos de la microscopía de iluminación de plano selectivo, como el sombreado (ver la primera pila z de arriba) [ 8 ].
  • Además de las láminas de luz que se propagan en direcciones opuestas, en 2012 se propuso una configuración con detección desde dos lados opuestos. [ 9 ] [ 10 ] Esto permite medir pilas de z y rotación para una reconstrucción 3D completa de la muestra más rápidamente.
  • La lámina de luz también se puede crear escaneando un foco láser normal hacia arriba y hacia abajo. [ 11 ] Esto también permite el uso de haces autorreconstruibles (como haces Bessel o haces Airy ) para la iluminación, lo que mejora la penetración de la lámina de luz en muestras gruesas, ya que se reduce el efecto negativo de la dispersión sobre la lámina de luz. [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] Estos haces autorreconstruibles se pueden modificar para contrarrestar las pérdidas de intensidad utilizando técnicas de compensación de atenuación, aumentando aún más la señal recolectada dentro de muestras gruesas. [ 16 ]
  • En la microscopía de plano oblicuo (OPM) [ 17 ], el objetivo de detección se utiliza también para crear la lámina de luz: la lámina de luz se emite desde este objetivo con un ángulo de aproximadamente 60°. Se utiliza óptica adicional para inclinar el plano focal utilizado para la detección con el mismo ángulo.
  • La microscopía de fluorescencia de lámina de luz también se ha combinado con la excitación de dos fotones (2P) , lo que mejora la penetración en muestras gruesas y dispersoras. [ 18 ] El uso de la excitación 2P en longitudes de onda del infrarrojo cercano se ha utilizado para reemplazar la excitación 1P en longitudes de onda azul-visibles en experimentos de imágenes cerebrales que implican la respuesta a estímulos visuales. [ 19 ]
  • La microscopía de iluminación de plano selectivo también se puede combinar con técnicas como la espectroscopia de correlación de fluorescencia , para permitir mediciones de movilidad con resolución espacial de partículas fluorescentes (por ejemplo, microesferas fluorescentes, puntos cuánticos o proteínas marcadas con fluorescencia) dentro de muestras biológicas vivas. [ 20 ] [ 21 ]
  • También se ha descrito una combinación de un microscopio de iluminación de plano selectivo con una cámara intensificadora de imagen con obturador que permitió medir un mapa de tiempos de vida de fluorescencia ( imagen de tiempo de vida de fluorescencia , FLIM). [ 22 ]
  • La microscopía de fluorescencia de lámina de luz se combinó con técnicas de microscopía de superresolución para mejorar su resolución más allá del límite de Abbe. [ 23 ] [ 24 ] También se ha publicado una combinación de microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED) y microscopía de iluminación de plano selectivo, que conduce a un espesor de lámina de luz reducido debido al efecto de la microscopía de agotamiento por emisión estimulada. [ 25 ] Véase también la sección sobre el poder de resolución de la microscopía de fluorescencia de lámina de luz más adelante.
  • La microscopía de fluorescencia de lámina de luz se modificó para que fuera compatible con todos los objetivos, incluso con los objetivos de inmersión en aceite basados ​​en cubreobjetos con alta apertura numérica, para aumentar la resolución espacial nativa y la eficiencia de detección de fluorescencia. [ 26 ] Esta técnica consiste en inclinar la lámina de luz con respecto al objetivo de detección en un ángulo preciso para permitir que la lámina de luz se forme en la superficie de los cubreobjetos de vidrio.
  • La microscopía de fluorescencia de lámina de luz se combinó con técnicas de óptica adaptativa en 2012 para mejorar la profundidad de imagen en muestras gruesas e inhomogéneas a una profundidad de 350  µm. [ 27 ] Se colocó un sensor de frente de onda Shack-Hartmann en la trayectoria de detección y se utilizaron estrellas guía en un bucle de retroalimentación cerrado. En su tesis, [ 28 ] el autor analiza la ventaja de tener óptica adaptativa tanto en la trayectoria de iluminación como en la de detección del microscopio de fluorescencia de lámina de luz para corregir las aberraciones inducidas por la muestra.

Montaje de la muestra

Diferentes tipos de montaje de muestras para microscopía de fluorescencia de lámina de luz: embrión incrustado en cilindro de gel colgante, planta creciendo en cilindro de gel con soporte, células adherentes sobre vidrio, muestra líquida en una bolsa para muestras.

La separación de los haces de iluminación y detección en la microscopía de fluorescencia de lámina de luz (excepto en la microscopía de plano oblicuo ) requiere métodos especializados de montaje de muestras. Hasta la fecha, la mayoría de los microscopios de fluorescencia de lámina de luz están construidos de tal manera que los haces de iluminación y detección se encuentran en un plano horizontal (véanse las ilustraciones anteriores), por lo que la muestra suele colgar desde la parte superior hacia la cámara de muestras o apoyarse sobre un soporte vertical dentro de la misma. Se han desarrollado varios métodos para montar todo tipo de muestras:

  • Las muestras fijadas (y potencialmente también las transparentadas) se pueden pegar a un soporte o abrazadera simple y pueden permanecer en su solución fijadora durante el proceso de obtención de imágenes.
  • Los organismos vivos de mayor tamaño suelen ser sedados y montados en un cilindro de gel blando que se extruye desde un capilar (de vidrio o plástico) que cuelga desde arriba hacia la cámara de muestras.
  • Las células adherentes pueden cultivarse en pequeñas placas de vidrio que cuelgan en la cámara de muestras.
  • Las plantas se pueden cultivar en geles transparentes que contienen un medio de cultivo . Los geles se cortan en la posición de la imagen, por lo que no reducen la lámina de luz ni la calidad de la imagen por dispersión y absorción. [ 29 ]
  • Las muestras líquidas (por ejemplo, para espectroscopia de correlación de fluorescencia ) pueden colocarse en pequeñas bolsas hechas de una lámina de plástico delgada que coincida con el índice de refracción del medio de inmersión circundante en la cámara de muestras. [ 21 ]

Se han desarrollado algunos microscopios de fluorescencia de lámina de luz en los que la muestra se monta como en la microscopía estándar (por ejemplo, células que crecen horizontalmente en el fondo de una placa de Petri ) y la óptica de excitación y detección se construye en un plano vertical desde arriba. Esto también permite combinar un microscopio de fluorescencia de lámina de luz con un microscopio invertido estándar y evita la necesidad de procedimientos especializados de montaje de muestras. [ 20 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]

Propiedades de la imagen

Modos de imagen típicos

La mayoría de los microscopios de fluorescencia de lámina de luz se utilizan para producir imágenes 3D de la muestra moviendo esta a través del plano de imagen. Si la muestra es mayor que el campo de visión del sensor de imagen , también debe desplazarse lateralmente. Un enfoque alternativo consiste en mover el plano de imagen a través de la muestra para crear la pila de imágenes. [ 32 ]

Se pueden realizar experimentos prolongados, por ejemplo, con secuencias de imágenes registradas cada 10  segundos o 10  minutos durante varios días. Esto permite estudiar los cambios a lo largo del tiempo en 3D, o microscopía 4D.

Tras la adquisición de la imagen, las distintas pilas de imágenes se registran para formar un único conjunto de datos 3D. Se pueden obtener múltiples vistas de la muestra, ya sea intercambiando las funciones de los objetivos [ 32 ] o rotando la muestra [ 8 ] . Disponer de múltiples vistas puede proporcionar más información que una sola pila; por ejemplo, se puede superar la oclusión de algunas partes de la muestra. Las múltiples vistas también mejoran la resolución de la imagen 3D al compensar la baja resolución axial, como se describe a continuación.

Algunos estudios también utilizan un microscopio de iluminación de plano selectivo para obtener imágenes de una sola sección de la muestra, pero con una resolución temporal mucho mayor . Esto permite, por ejemplo, observar el latido del corazón de un embrión de pez cebra en tiempo real. [ 33 ] Junto con etapas de traslación rápidas para la muestra, se ha implementado un seguimiento de partículas 3D de alta velocidad. [ 34 ]

Poder de resolución

La resolución lateral de un microscopio de iluminación de plano selectivo es comparable a la de un microscopio de fluorescencia (epi) estándar, ya que está determinada completamente por el objetivo de detección y la longitud de onda de la luz detectada (ver límite de Abbe ). Por ejemplo, para la detección en la región espectral verde alrededor de 525 nm, se puede alcanzar  una resolución de 250–500 nm. [ 7 ] La resolución axial es peor que la lateral (aproximadamente un factor de 4), pero se puede mejorar utilizando una lámina de luz más delgada en cuyo caso es posible una resolución casi isotrópica. [ 20 ] Las láminas de luz más delgadas son delgadas solo en una pequeña región (para haces gaussianos ) o bien se deben utilizar perfiles de haz especializados como haces de Bessel (además de la complejidad añadida, tales esquemas añaden lóbulos laterales que pueden ser perjudiciales). [ 13 ] Alternativamente, se puede lograr una resolución isotrópica combinando computacionalmente pilas de imágenes 3D tomadas de la misma muestra bajo diferentes ángulos. Luego, la información de resolución de profundidad que falta en una pila se proporciona a partir de otra pila; Por ejemplo, con dos pilas ortogonales, la dirección axial (de baja resolución) en una pila es una dirección lateral (de alta resolución) en la otra pila. 

La resolución lateral de la microscopía de fluorescencia de lámina de luz se puede mejorar más allá del límite de Abbe, utilizando técnicas de microscopía de superresolución , por ejemplo, aprovechando que los fluoróforos individuales se pueden localizar con una precisión espacial mucho mayor que la resolución nominal del sistema óptico utilizado (véanse las técnicas de microscopía de localización estocástica ). [ 23 ] En la microscopía de lámina de luz con iluminación estructurada , se han aplicado técnicas de iluminación estructurada para mejorar aún más la capacidad de seccionamiento óptico de la microscopía de fluorescencia de lámina de luz. [ 24 ]

artefactos de rayas

Arriba: artefactos de rayas en la microscopía de fluorescencia de lámina de luz. Abajo: reducción de artefactos de rayas mediante pivoteo.

Como la iluminación suele penetrar la muestra desde un lado, los obstáculos que se interponen en el camino de la lámina de luz pueden alterar su calidad al dispersar o absorber la luz. Esto suele generar franjas oscuras y brillantes en las imágenes. Si algunas partes de las muestras tienen un índice de refracción significativamente mayor (por ejemplo, vesículas lipídicas en las células), también pueden producir un efecto de enfoque que da lugar a franjas brillantes detrás de estas estructuras. Para superar este artefacto, las láminas de luz pueden, por ejemplo, ser "pivotantes". Esto significa que la dirección de incidencia de la lámina de luz cambia rápidamente (a una  frecuencia de ~1 kHz) unos pocos grados (~10°), de modo que la luz también incide en las regiones detrás de los obstáculos. La iluminación también puede realizarse con dos láminas de luz (pivotantes) (véase más arriba) para reducir aún más estos artefactos. [ 8 ] Como alternativa, se ha desarrollado el algoritmo Variational Stationary Noise Remover (VSNR), disponible como complemento gratuito de Fiji. [ 35 ]

Historia

A principios del siglo XX, R. A. Zsigmondy introdujo el ultramicroscopio como un nuevo método de iluminación en la microscopía de campo oscuro. En este método, se utiliza luz solar o una lámpara blanca para iluminar una rendija de precisión. La rendija se proyecta sobre la muestra mediante una lente condensadora, formando una lámina de luz. Las partículas dispersas (subdifractivas) pueden observarse perpendicularmente con un microscopio. Esta configuración permitió la observación de partículas con tamaños inferiores a la resolución del microscopio y le valió a Zsigmondy el Premio Nobel en 1925. [ 36 ]

La primera aplicación de este esquema de iluminación para microscopía de fluorescencia fue publicada en 1993 por Voie et al. bajo el nombre de sección óptica de fluorescencia de plano ortogonal (OPFOS). [ 4 ] para la obtención de imágenes de la estructura interna de la cóclea . La resolución en ese momento estaba limitada a 10  µm lateralmente y 26  µm longitudinalmente, pero con un tamaño de muestra en el rango de milímetros. El microscopio de sección óptica de fluorescencia de plano ortogonal utilizaba una lente cilíndrica simple para la iluminación. El desarrollo y la mejora del microscopio de iluminación de plano selectivo comenzaron en 2004. [ 5 ] Después de esta publicación de Huisken et al., la técnica encontró una amplia aplicación y todavía se adapta a nuevas situaciones de medición en la actualidad (ver más arriba). Desde 2010, un primer ultramicroscopio con excitación de fluorescencia y resolución limitada [ 37 ] y desde 2012, un primer microscopio de iluminación de plano selectivo están disponibles comercialmente. [ 38 ] Una buena descripción general sobre el desarrollo de la microscopía de iluminación de plano selectivo se da en la ref. [ 39 ] Durante 2012 también comenzaron a aparecer proyectos de código abierto que publican libremente planos de construcción completos para microscopios de fluorescencia de lámina de luz y también los paquetes de software necesarios. [ 40 ] [ 41 ] [ 42 ] [ 43 ]

Aplicaciones

La microscopía de iluminación de plano selectivo/microscopía de fluorescencia de lámina de luz se utiliza a menudo en biología del desarrollo, donde permite observaciones prolongadas (varios días) del desarrollo embrionario (incluso con reconstrucción completa del árbol de linaje). [ 5 ] [ 44 ] En criaturas transparentes como la larva del pez cebra , la microscopía de lámina de luz puede visualizar la actividad del sistema nervioso de un animal vivo y en comportamiento. [ 45 ] La microscopía de iluminación de plano selectivo también se puede combinar con técnicas, como la espectroscopía de correlación de fluorescencia para permitir mediciones de movilidad con resolución espacial de partículas fluorescentes (por ejemplo, microesferas fluorescentes, puntos cuánticos o proteínas fluorescentes) dentro de muestras biológicas vivas. [ 20 ] [ 21 ]

Los tejidos biológicos que dispersan fuertemente la luz, como el cerebro o el riñón, deben fijarse químicamente y aclararse antes de poder ser observados en un microscopio de iluminación de plano selectivo. [ 46 ] Se han desarrollado técnicas especiales de aclaramiento de tejidos para este fin, por ejemplo, 3DISCO , CUBIC y CLARITY . Dependiendo del índice de refracción de la muestra aclarada, se deben utilizar fluidos de inmersión adecuados y objetivos especiales de largo alcance durante la obtención de imágenes.

Referencias

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Lecturas adicionales

  • Revisión: PA Santi (1 de febrero de 2011). "Microscopía de fluorescencia de lámina de luz: una revisión" . Journal of Histochemistry & Cytochemistry . 59 (2): 129– 138. doi : 10.1369/0022155410394857 . ISSN 0022-1554 . PMC 3201139. PMID 21339178 .   
  • Revisión de diferentes modalidades y resultados de microscopía de fluorescencia de lámina de luz en biología del desarrollo: Huisken, J.; Stainier, DYR (22 de mayo de 2009). " Técnicas de microscopía de iluminación de plano selectivo en biología del desarrollo" . Development . 136 (12): 1963–1975 . doi : 10.1242/dev.022426 . ISSN 0950-1991 . PMC 2685720. PMID 19465594 .   
  • Revisión de la microscopía de fluorescencia de lámina de luz para la obtención de imágenes de estructuras anatómicas: Buytaert, J.; Descamps, Emilie; Adriaens, Dominique; Dirckx, Joris JJ (12 de agosto de 2011). "La familia de microscopía OPFOS: seccionamiento óptico de alta resolución de especímenes biomédicos" . Anatomy Research International . 2012 : 206238–(1–9). arXiv : 1106.3162 . Bibcode : 2011arXiv1106.3162B . doi : 10.1155/2012/206238 . PMC 3335623. PMID 22567307 .  
  • Editorial: "Método del año 2014" . Nature Methods . 12 (1): 1. 30 de diciembre de 2014. doi : 10.1038/nmeth.3251 . PMID 25699311 . 
  • Vídeo de un experimento típico en biología del desarrollo, utilizando un SPIM (Sistema de Información de Mosca) en YouTube : El vídeo enlazado muestra el desarrollo de un embrión de mosca de la fruta, grabado durante 20 horas. Se muestran dos proyecciones del conjunto completo de datos 3D.
  • La iniciativa mesoSPIM. Microscopios de lámina de luz de código abierto para la obtención de imágenes de tejido transparentado.
  • Una guía práctica para la microscopía de lámina de luz adaptativa