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El corte óptico es el proceso mediante el cual un microscopio diseñado adecuadamente puede producir imágenes claras de los planos focales en las profundidades de una muestra gruesa. Esto se utiliza para reducir la necesidad de cortes finos utilizando instrumentos como el micrótomo . Se utilizan muchas técnicas diferentes para el corte óptico y varias técnicas de microscopía están diseñadas específicamente para mejorar la calidad del corte óptico.
Un buen seccionamiento óptico, a menudo denominado buena profundidad o resolución z, es popular en la microscopía moderna ya que permite la reconstrucción tridimensional de una muestra a partir de imágenes capturadas en diferentes planos focales.
Seccionamiento óptico en microscopios ópticos tradicionales
En un microscopio ideal, solo la luz del plano focal podría llegar al detector (normalmente un observador o un CCD ), lo que produciría una imagen clara del plano de la muestra en el que se enfoca el microscopio. Desafortunadamente, un microscopio no es tan específico y la luz de fuentes externas al plano focal también llega al detector; en una muestra gruesa puede haber una cantidad significativa de material y, por lo tanto, una señal espuria entre el plano focal y la lente del objetivo .
Sin ninguna modificación en el microscopio, es decir, con un microscopio óptico de campo amplio simple , la calidad del seccionamiento óptico está regida por la misma física que el efecto de profundidad de campo en fotografía . Para una lente de apertura numérica alta , equivalente a una apertura amplia , la profundidad de campo es pequeña ( enfoque superficial ) y proporciona un buen seccionamiento óptico. Las lentes de objetivo de gran aumento suelen tener aperturas numéricas más altas (y, por lo tanto, un mejor seccionamiento óptico) que los objetivos de bajo aumento. Los objetivos de inmersión en aceite suelen tener aperturas numéricas aún mayores, por lo que mejoran el seccionamiento óptico.
La resolución en la dirección de profundidad (la "resolución z") de un microscopio de campo amplio estándar depende de la apertura numérica y de la longitud de onda de la luz y se puede aproximar como:
donde λ es la longitud de onda, n el índice de refracción del medio de inmersión de la lente objetivo y NA la apertura numérica. [2]
En comparación, la resolución lateral se puede aproximar como: [3]
Técnicas para mejorar el seccionamiento óptico
Microscopía óptica de campo claro
Aparte de aumentar la apertura numérica, existen pocas técnicas disponibles para mejorar el seccionamiento óptico en la microscopía óptica de campo claro. La mayoría de los microscopios con objetivos de inmersión en aceite están alcanzando los límites de apertura numérica posibles debido a los límites de refracción .
El contraste de interferencia diferencial (DIC) proporciona mejoras modestas en el seccionamiento óptico. En el DIC, la muestra se ilumina de manera efectiva mediante dos fuentes de luz ligeramente desfasadas que luego interfieren para producir una imagen resultante de las diferencias de fase de las dos fuentes. Como la diferencia en las fuentes de luz es pequeña, la única diferencia en la fase resulta del material cercano al plano focal.
Microscopía de fluorescencia
En la microscopía de fluorescencia, los objetos que se encuentran fuera del plano focal solo interfieren en la imagen si están iluminados y emiten fluorescencia. Esto agrega una forma adicional de mejorar el seccionamiento óptico al hacer que la iluminación sea específica solo para el plano focal.
La microscopía confocal utiliza uno o más puntos de luz para iluminar la muestra. Junto con un orificio en un plano focal conjugado, esto actúa para filtrar la luz de fuentes fuera del plano focal para mejorar el seccionamiento óptico. [4]
La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz ilumina la muestra con luz de excitación bajo un ángulo de 90° con respecto a la dirección de observación, es decir, solo se ilumina el plano focal utilizando un láser que solo se enfoca en una dirección (lámina de luz). [5] Este método reduce eficazmente la luz fuera de foco y, además, puede conducir a una mejora modesta en la resolución longitudinal, en comparación con la microscopía de epifluorescencia.
Las técnicas de excitación dual y multifotónica aprovechan el hecho de que los fluoróforos pueden ser excitados no sólo por un único fotón de la energía correcta , sino también por múltiples fotones, que juntos proporcionan la energía correcta. El efecto adicional dependiente de la " concentración " de requerir que múltiples fotones interactúen simultáneamente con un fluoróforo proporciona estimulación sólo muy cerca del plano focal. Estas técnicas se utilizan normalmente junto con la microscopía confocal. [6]
Se están desarrollando activamente otras mejoras en el seccionamiento óptico, que funcionan principalmente mediante métodos para sortear el límite de difracción de la luz. Algunos ejemplos incluyen la interferometría de fotón único a través de dos lentes objetivo para brindar información de profundidad extremadamente precisa sobre un solo fluoróforo [7] y la microscopía de iluminación estructurada tridimensional [8] .
El seccionamiento óptico de los microscopios de campo amplio normales se puede mejorar significativamente mediante la deconvolución , una técnica de procesamiento de imágenes para eliminar el desenfoque de la imagen de acuerdo con una función de dispersión de puntos medida o calculada . [9]
Agentes de compensación
El seccionamiento óptico se puede mejorar mediante el uso de agentes de limpieza que poseen un alto índice de refracción (>1,4) como el alcohol bencílico/benzoato de bencilo (BABB) o el éter bencílico [10] que hacen que las muestras sean transparentes y, por lo tanto, permiten la observación de estructuras internas.
Otro
El corte óptico está poco desarrollado en microscopios no ópticos. [ cita requerida ]
Los microscopios de rayos X y electrónicos suelen tener una gran profundidad de campo (corte óptico deficiente) y, por lo tanto, el corte fino de muestras todavía se utiliza ampliamente.
Aunque una física similar guía el proceso de enfoque, [11] los microscopios de sonda de barrido y los microscopios electrónicos de barrido no suelen analizarse en el contexto del seccionamiento óptico, ya que estos microscopios solo interactúan con la superficie de la muestra.
La microscopía de reflexión interna total es una técnica de microscopía fluorescente que restringe intencionalmente la observación a las superficies superior o inferior de una muestra, pero con una resolución de profundidad extremadamente alta.
Se ha demostrado teórica y experimentalmente que la obtención de imágenes en 3D mediante una combinación de seccionamiento focal e inclinación proporciona una resolución 3D excepcional en grandes campos de visión. [12]
Alternativas
Las principales alternativas al seccionamiento óptico son:
- Corte fino de la muestra, como por ejemplo el que se utiliza en histología .
- Tomografía , especialmente desarrollada para la microscopía electrónica de transmisión .
Referencias
- ^ Qian, Jia; Lei, Ming; Dan, Dan; Yao, Baoli; Zhou, Xing; Yang, Yanlong; Yan, Shaohui; Min, Junwei; Yu, Xianghua (2015). "Microscopía de corte óptico con iluminación estructurada a todo color". Informes científicos . 5 : 14513. Código Bib : 2015NatSR...514513Q. doi :10.1038/srep14513. PMC 4586488 . PMID 26415516.
- ^ Nikon MicroscopyU – Profundidad de campo y profundidad de enfoque
- ^ Nikon MicroscopyU – Resolución
- ^ Conchello JA, Lichtman JW (diciembre de 2005). "Microscopía de corte óptico". Nat. Methods . 2 (12): 920–31. doi :10.1038/nmeth815. PMID 16299477. S2CID 17722926.
- ^ Huisken, J.; Swoger, J.; Bene, F. Del; Wittbrodt, J.; Stelzer, EH (2004). "Corte óptico en el interior profundo de embriones vivos mediante microscopía de iluminación selectiva del plano". Science . 305 (5686): 1007–1009. Bibcode :2004Sci...305.1007H. CiteSeerX 10.1.1.456.2250 . doi :10.1126/science.1100035. PMID 15310904. S2CID 3213175.
- ^ Gratton E, Barry NP, Beretta S, Celli A (septiembre de 2001). "Microscopía de fluorescencia multifotónica". Métodos . 25 (1): 103–10. doi :10.1006/meth.2001.1219. PMID 11559001. S2CID 822155.
- ^ Shtengel G, Galbraith JA, Galbraith CG, et al. (marzo de 2009). "La microscopía interferométrica fluorescente de súper resolución resuelve la ultraestructura celular en 3D". Proc. Natl. Sci. USA . 106 (9): 3125–30. Bibcode :2009PNAS..106.3125S. doi : 10.1073/pnas.0813131106 . PMC 2637278 . PMID 19202073.
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- ^ Sibarita JB (2005). "Microscopía de deconvolución". Adv. Biochem. Eng. Biotechnol . Avances en ingeniería bioquímica/biotecnología. 95 : 201–43. doi :10.1007/b102215. ISBN 978-3-540-23698-6. Número de identificación personal 16080270.
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{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace ) - ^ Borisevich, AY; Lupini, AR; Pennycook, SJ (21 de febrero de 2006). "Corte en profundidad con el microscopio electrónico de transmisión de barrido con corrección de aberración". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 103 (9): 3044–3048. Bibcode :2006PNAS..103.3044B. doi : 10.1073/pnas.0507105103 . PMC 1413870 . PMID 16492746.
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