Microscopía de superresolución

La microscopía de efecto túnel de fotones (PTM) ^{[ 20 ]} proporciona imágenes de campo completo en tiempo real sin escaneo con resolución lateral sublongitudinal y resolución vertical de tan solo 1 nanómetro, como lo demostró John M. Guerra ^{[ 21 ]} . (Nótese la diferenciación de PTM con la microscopía de efecto túnel de escaneo de fotones (PSTM), que es esencialmente un cambio de nombre de la microscopía óptica de escaneo de campo cercano (NSOM) que explota el campo cercano de una punta de fibra óptica afilada posicionada extremadamente cerca de la superficie de la muestra, típicamente a unos pocos nanómetros, de modo que cuando la fibra se escanea a lo largo de la superficie de la muestra se construye una imagen).

La PTM proporciona una resolución espacial sublongitudinal gracias a la captura de la luz difractada de alta frecuencia ligada a la muestra y su conversión en luz propagante formadora de imágenes. La fácil inserción de la superficie de la muestra en el campo evanescente en el extremo distal del microscopio se logra mediante un "transductor" flexible de polímero o vidrio delgado que se coloca cerca de la muestra. ^{[ 22 ]} Este transductor es lo suficientemente flexible como para seguir las macrocurvas de la muestra, a la vez que proporciona una referencia plana y rígida localmente. La resolución vertical está limitada únicamente por la resolución fotométrica del detector de campo completo y puede ser tan baja como 1 nanómetro. La técnica se ha aplicado a muestras biológicas y de estado sólido, ofreciendo información sobre la morfología de la superficie y las propiedades ópticas a nanoescala.

En un desarrollo posterior de este trabajo en 1996, John M. Guerra demostró que se puede obtener una topografía lateral superresuelta, incluso mayor que la lograda con PTM, mediante el desplazamiento de fase del campo evanescente. En la luz propagada, los planos de igual fase son paralelos a los planos de igual amplitud, de modo que el desplazamiento de fase produce una superresolución sublongitudinal a lo largo del eje vertical, como la que se logra con los interferómetros fabricados por WYKO y ZYGO para la medición de superficies ópticas. Sin embargo, el campo evanescente es inhomogéneo, ya que los planos de igual amplitud son paralelos a la superficie de la muestra (de ahí la alta resolución vertical en PTM), mientras que los planos de igual fase son perpendiculares a ellos y a la superficie. Por lo tanto, el desplazamiento de fase puede producir una superresolución sublongitudinal en el eje lateral que es incluso mayor que la de PTM. Si bien existen muchas maneras de iniciar este desplazamiento de fase, como enseñó Guerra en varias patentes estadounidenses ^{[ 23 ]} asignadas a Polaroid Corporation , la primera demostración empleó una combinación de retardador de fase y polarizador de Meadowlark Optics . La resta de imágenes consecutivas para las cuales la fase se desplazó por un pequeño valor produjo resolución. Dyer Energy Systems, Calimetrics Inc. y Nanoptek Corp. adquirieron licencias de esta tecnología para el uso de esta técnica de superresolución en almacenamiento de datos ópticos y microscopía. En 2001, junto con Dmitri Vezenov, Guerra publicó ^{[ 24 ]} una imagen completamente resuelta de esferas de 200 nm, empaquetadas hexagonalmente de forma compacta, mientras se iluminaban con luz de 650 nm, para una resolución de 0,3 lambda. Si bien es impresionante, la resolución potencial puede ser mucho mayor, ya que está limitada únicamente por la magnitud del desplazamiento de fase.

La microscopía óptica de barrido de campo cercano sin apertura (ANSOM), también conocida como microscopía óptica de barrido de campo cercano por dispersión (s-SNOM), logra imágenes de superresolución mediante la intensificación local del campo óptico cerca de una punta afilada, generalmente metálica. En ANSOM, una sonda metálica o dieléctrica interactúa con la luz incidente, creando un campo electromagnético confinado e intensificado en el ápice de la punta debido a la resonancia de plasmones de superficie localizada .

Las nanoantenas ópticas pueden mejorar aún más la resolución al actuar como resonadores que concentran la luz en volúmenes a nanoescala, aumentando así la intensidad del campo local y la sensibilidad. Estas nanoantenas están diseñadas para resonar a frecuencias ópticas específicas y se utilizan tanto en modos de iluminación como de detección para lograr resoluciones espaciales muy inferiores al límite de difracción.

La microscopía de mapeo aleatorio óptico de campo cercano (NORM) es un método de adquisición óptica de campo cercano mediante un microscopio de campo lejano a través de la observación del movimiento browniano de nanopartículas en un líquido de inmersión. ^{[ 25 ] [ 26 ]}

NORM utiliza el escaneo de la superficie del objeto mediante el movimiento estocástico de nanopartículas. A través del microscopio, las nanopartículas se ven como puntos redondos simétricos. El ancho del punto es equivalente a la función de dispersión puntual (~250  nm) y está definido por la resolución del microscopio. Las coordenadas laterales de la partícula en cuestión se pueden evaluar con una precisión mucho mayor que la resolución del microscopio. Al recopilar la información de múltiples fotogramas, se puede mapear la distribución de intensidad del campo cercano en todo el campo de visión del microscopio. En comparación con NSOM y ANSOM, este método no requiere ningún equipo especial para el posicionamiento de la punta y tiene un amplio campo de visión y una gran profundidad de campo. Gracias a la gran cantidad de sensores de escaneo, se puede lograr la adquisición de imágenes en un tiempo menor.

Un microscopio 4Pi es un microscopio de fluorescencia de barrido láser con una resolución axial mejorada . El valor típico de 500–700 nm se puede mejorar a 100–150 nm, lo que corresponde a un punto focal casi esférico con un volumen 5–7 veces menor que el de la microscopía confocal estándar .  

La mejora en la resolución se logra mediante el uso de dos lentes objetivo opuestas, ambas enfocadas en la misma ubicación geométrica. Además, la diferencia en la longitud del recorrido óptico a través de cada una de las dos lentes objetivo se minimiza cuidadosamente. De esta manera, las moléculas que se encuentran en el área focal común de ambos objetivos pueden iluminarse coherentemente desde ambos lados, y la luz reflejada o emitida puede recolectarse coherentemente, es decir, es posible la superposición coherente de la luz emitida en el detector. El ángulo sólido${\displaystyle \Omega }$que se utiliza para la iluminación y la detección aumenta y se aproxima al caso ideal, donde la muestra se ilumina y detecta desde todos los lados simultáneamente. ^{[ 27 ] [ 28 ]}

Hasta ahora, la mejor calidad en un microscopio 4Pi se ha logrado en combinación con la microscopía STED en células fijas ^{[ 29 ]} y la microscopía RESOLFT con proteínas conmutables en células vivas. ^{[ 30 ]}

La microscopía de iluminación estructurada (SIM) mejora la resolución espacial al recopilar información del espacio de frecuencias fuera de la región observable. Este proceso se realiza en el espacio recíproco: la transformada de Fourier (TF) de una imagen SI contiene información adicional superpuesta de diferentes áreas del espacio recíproco; con varios fotogramas donde la iluminación se desplaza en cierta fase , es posible separar y reconstruir computacionalmente la imagen TF, que contiene mucha más información de resolución. La TF inversa devuelve la imagen reconstruida a una imagen de superresolución.

La SIM podría potencialmente reemplazar la microscopía electrónica como herramienta para algunos diagnósticos médicos. Estos incluyen el diagnóstico de trastornos renales, ^{[ 31 ]} cáncer de riñón, ^{[ 32 ]} y enfermedades de la sangre. ^{[ 33 ]}

Aunque el término "microscopía de iluminación estructurada" fue acuñado por otros años después, John M. Guerra (1995) publicó por primera vez resultados ^{[ 34 ]} en los que la luz, modelada por una  rejilla de 50 nm de paso, iluminaba una segunda rejilla de 50  nm de paso, con las rejillas rotadas entre sí en el ángulo necesario para lograr la magnificación. Si bien la longitud de onda de iluminación era de 650  nm, la  rejilla de 50 nm se resolvía fácilmente. Esto demostró una mejora de casi cinco veces con respecto al límite de resolución de Abbe de 232  nm, que debería haber sido el mínimo obtenido para la apertura numérica y la longitud de onda utilizadas.

• Imágenes de núcleos celulares y fases mitóticas registradas con 3D-SIM.
• 
  Microscopía confocal comparativa  – 3D-SIM
• 
  Núcleo celular en profase desde varios ángulos
• 
  Dos núcleos de células de ratón en profase.
• 
  célula de ratón en telofase

Una implementación de la iluminación estructurada se conoce como iluminación modulada espacialmente (SMI). Al igual que la iluminación estructurada estándar, la técnica SMI modifica la función de dispersión puntual (PSF) de un microscopio de manera adecuada. En este caso, sin embargo, "la resolución óptica en sí misma no se mejora"; ^{[ 35 ]} en cambio, la iluminación estructurada se utiliza para maximizar la precisión de las mediciones de distancia de objetos fluorescentes, para "permitir mediciones de tamaño a dimensiones moleculares de unas pocas decenas de nanómetros". ^{[ 35 ]}

El microscopio Vertico SMI logra una iluminación estructurada mediante el uso de uno o dos haces láser interferentes opuestos a lo largo del eje. El objeto que se está visualizando se mueve en pasos de alta precisión a través del campo de ondas, o bien el propio campo de ondas se mueve con respecto al objeto mediante cambios de fase. Esto da como resultado una resolución axial y de distancia mejorada. ^{[ 35 ] [ 36 ] [ 37 ]}

SMI se puede combinar con otras tecnologías de superresolución, por ejemplo con 3D LIMON o LSI- TIRF como un interferómetro de reflexión interna total con iluminación estructurada lateralmente (este último instrumento y técnica es esencialmente un microscopio de tunelización de fotones con desplazamiento de fase, que emplea un microscopio de luz de reflexión interna total con campo evanescente con desplazamiento de fase (John M. Guerra, 1996). ^{[ 23 ]} Esta técnica SMI permite adquirir imágenes ópticas de distribuciones de autofluoróforos en secciones de tejido ocular humano con una resolución óptica sin precedentes. El uso de tres longitudes de onda de excitación diferentes (488, 568 y 647  nm) permite obtener información espectral sobre la señal de autofluorescencia . Esto se ha utilizado para examinar tejido ocular humano afectado por degeneración macular . ^{[ 38 ]}

La biodetección es crucial para comprender las actividades de los componentes celulares en la biología celular. Los sensores codificados genéticamente han transformado este campo y suelen constar de dos partes: el dominio de detección, que detecta la actividad o las interacciones celulares, y el dominio de reporte, que produce señales medibles. Existen dos tipos principales de sensores: los sensores basados ​​en FRET, que utilizan dos fluoróforos para una cuantificación precisa pero con algunas limitaciones, y los biosensores de un solo fluoróforo, que son más pequeños, más rápidos y permiten experimentos multiplexados, pero pueden presentar dificultades para obtener valores absolutos y detectar la saturación de la respuesta. Se han utilizado diversos métodos de microscopía, incluyendo la imagen de fluctuación óptica de superresolución, para cuantificar y monitorizar actividades biológicas en tiempo real. Algunos ejemplos son la detección de calcio, pH y voltaje. Greenwald et al. ofrecen una visión general más completa de estas aplicaciones. ^{[ 39 ]}

Stimulated emission depletion microscopy (STED microscopy) uses two laser pulses, the excitation pulse for excitation of the fluorophores to their fluorescent state and the STED pulse for the de-excitation of fluorophores by means of stimulated emission.^{[19][44][45][46][47][48]} In practice, the excitation laser pulse is first applied whereupon a STED pulse soon follows (STED without pulses using continuous wave lasers is also used). Furthermore, the STED pulse is modified in such a way so that it features a zero-intensity spot that coincides with the excitation focal spot. Due to the non-linear dependence of the stimulated emission rate on the intensity of the STED beam, all the fluorophores around the focal excitation spot will be in their off state (the ground state of the fluorophores). By scanning this focal spot, one retrieves the image. The full width at half maximum (FWHM) of the point spread function (PSF) of the excitation focal spot can theoretically be compressed to an arbitrary width by raising the intensity of the STED pulse, according to equation (1).

${\displaystyle \Delta r\approx {\frac {\Delta }{\sqrt {1+I_{\max }/I_{s}}}}}$   (1)

where ∆r is the lateral resolution, ∆ is the FWHM of the diffraction limited PSF, I_max is the peak intensity of the STED laser, and ${\displaystyle I_{s}}$ is the threshold intensity needed in order to achieve saturated emission depletion.

La principal desventaja de STED, que ha impedido su uso generalizado, es que la maquinaria es compleja. Por un lado, la velocidad de adquisición de imágenes es relativamente lenta para campos de visión amplios debido a la necesidad de escanear la muestra para obtener una imagen. Por otro lado, puede ser muy rápida para campos de visión más pequeños: se han mostrado grabaciones de hasta 80 fotogramas por segundo. ^{[ 49 ] [ 50 ]} Debido a un gran valor de I _s asociado con STED, es necesario un pulso de excitación de alta intensidad, lo que puede causar daños a la muestra.

La microscopía de agotamiento del estado fundamental (microscopía GSD) utiliza el estado triplete de un fluoróforo como estado apagado y el estado singlete como estado encendido, donde se utiliza un láser de excitación para llevar los fluoróforos en la periferia de la molécula en estado singlete al estado triplete. Esto es muy similar a STED, donde el estado apagado es el estado fundamental de los fluoróforos, razón por la cual la ecuación ( 1 ) también se aplica en este caso.${\displaystyle I_{s}}$El valor es menor que en STED, lo que permite obtener imágenes de superresolución con una intensidad láser mucho menor. Sin embargo, en comparación con STED, los fluoróforos utilizados en GSD son generalmente menos fotoestables; y la saturación del estado triplete puede ser más difícil de lograr. ^{[ 51 ]}

La microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM) aprovecha la dependencia no lineal de la tasa de emisión de los fluoróforos con respecto a la intensidad del láser de excitación. ^{[ 52 ]} Al aplicar un patrón de iluminación sinusoidal ^{[ 53 ]} con una intensidad máxima cercana a la necesaria para saturar los fluoróforos en su estado fluorescente, se obtienen franjas de Moiré. Estas franjas contienen información espacial de alto orden que puede extraerse mediante técnicas computacionales. Una vez extraída la información, se obtiene una imagen de superresolución.

La técnica SSIM requiere cambiar el patrón de iluminación varias veces, lo que limita la resolución temporal . Además, debido a las condiciones de saturación, se necesitan fluoróforos muy fotoestables, que dañan la muestra por radiación y restringen las posibles aplicaciones de SSIM.

En la sección Microscopía de iluminación estructurada (SIM) se muestran ejemplos de esta técnica : imágenes de núcleos celulares y fases mitóticas registradas con microscopía 3D-SIM.

La microscopía de localización de molécula única (SMLM) engloba todas las técnicas microscópicas que logran superresolución aislando emisores y ajustando sus imágenes con la función de dispersión puntual (PSF). Normalmente, el ancho de la función de dispersión puntual (~250  nm) limita la resolución. Sin embargo, dado un emisor aislado, es posible determinar su ubicación con una precisión limitada únicamente por su intensidad, según la ecuación ( 2 ). ^{[ 54 ]}

${\displaystyle \Delta \mathrm {loc} \approx {\frac {\Delta }{\sqrt {N}}}}$   ( 2 )

donde Δloc es la precisión de localización, Δ es el FWHM (ancho completo a media altura) de la PSF y N es el número de fotones recolectados.

Este proceso de ajuste solo puede realizarse de forma fiable para emisores aislados (véase Deconvolución ), y las muestras biológicas interesantes están tan densamente marcadas con emisores que el ajuste resulta imposible cuando todos los emisores están activos simultáneamente. Las técnicas SMLM resuelven este problema activando solo un subconjunto reducido de emisores a la vez, localizando estos pocos emisores con gran precisión, desactivándolos y activando otro subconjunto.

Considerando el fondo y la pixelación de la cámara, y utilizando la aproximación gaussiana para la función de dispersión de punto ( disco de Airy ) de un microscopio típico, la resolución teórica es propuesta por Thompson et al. ^{[ 55 ]} y ajustada por Mortensen et al.: ^{[ 56 ]}

${\displaystyle \sigma ^{2}={\frac {\sigma _{PSF}^{2}+a^{2}/12}{N_{sig}}}\left({\frac {16}{9}}+{\frac {8\pi N_{bg}(\sigma _{PSF}^{2}+a^{2}/12)}{N_{sig}a^{2}}}\right)}$

dónde

* σ es la desviación estándar gaussiana de las posiciones centrales de la misma molécula si se mide varias veces (por ejemplo, fotogramas de un vídeo). (unidad m)

* σ _PSF es la desviación estándar gaussiana de la función de dispersión de puntos, cuyo FWHM sigue la ecuación de Ernst Abbe d = λ/(2 NA) . (unidad m)

* a es el tamaño de cada píxel de la imagen. (unidad m)

* N _sig es el número de fotones de la PSF total sobre todos los píxeles de interés. (sin unidades)

* N _{bg es} el promedio de recuentos de fotones de fondo por píxel (recuentos oscuros ya eliminados), que se aproxima al cuadrado de la desviación estándar gaussiana del ruido de fondo de distribución de Poisson de cada píxel a lo largo del tiempo o a la desviación estándar de todos los píxeles con ruido de fondo únicamente, σ _bg ² . Cuanto mayor sea σ _bg ² , mejor será la aproximación (por ejemplo, buena para σ _bg ² >10, excelente para σ _bg ² >1000). (sin unidades)

* La resolución FWHM es ~2,355 veces la desviación estándar gaussiana .

Generalmente, la microscopía de localización se realiza con fluoróforos. Los fluoróforos adecuados (por ejemplo, para STORM) permanecen en un estado oscuro no fluorescente la mayor parte del tiempo y se activan estocásticamente, normalmente con un láser de excitación de baja intensidad. Un láser de lectura estimula la fluorescencia y blanquea o fotoconmuta los fluoróforos de vuelta a un estado oscuro, normalmente en 10-100 ms. En la técnica PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography), los fluoróforos no son fluorescentes antes de la unión y después se vuelven fluorescentes. Los fotones emitidos durante la fase fluorescente se recogen con una cámara y la imagen resultante del fluoróforo (que está distorsionada por la PSF) se puede ajustar con muy alta precisión, incluso del orden de unos pocos Angstroms. ^{[ 57 ]} Repetir el proceso miles de veces garantiza que todos los fluoróforos puedan pasar por el estado brillante y se registren. Un ordenador reconstruye entonces una imagen de superresolución.

Las características deseables de los fluoróforos utilizados en estos métodos, para maximizar la resolución, son su alta luminosidad. Es decir, deben tener un coeficiente de extinción elevado y un alto rendimiento cuántico . También deben poseer una alta relación de contraste (relación entre el número de fotones emitidos en estado iluminado y el número de fotones emitidos en estado oscuro). Asimismo, según el criterio de Nyquist , es deseable una muestra densamente marcada .

La multitud de métodos de microscopía de localización difieren principalmente en el tipo de fluoróforos utilizados.

Microscopía de distancia de precisión espectral (SPDM)

Una única y diminuta fuente de luz puede localizarse con mucha más precisión que la resolución habitual de un microscopio: aunque la luz produzca una mancha borrosa, se pueden utilizar algoritmos informáticos para calcular con exactitud el centro de dicha mancha, teniendo en cuenta la función de dispersión puntual del microscopio, las propiedades de ruido del detector, etc. Sin embargo, este método no funciona cuando hay demasiadas fuentes muy cerca unas de otras: en ese caso, todas las fuentes se difuminan entre sí.

La microscopía de distancia de precisión espectral (SPDM) es una familia de técnicas de localización en microscopía de fluorescencia que resuelve el problema de la presencia de múltiples fuentes midiendo solo unas pocas a la vez, de modo que cada fuente se encuentra "ópticamente aislada" de las demás (es decir, separada por una distancia mayor que la resolución del microscopio, típicamente ~200-250  nm). ^{[ 78 ] [ 79 ] [ 80 ]} Este "aislamiento óptico" requiere que las partículas bajo examen tengan diferentes firmas espectrales, de manera que sea posible observar la luz de solo unas pocas moléculas a la vez mediante el uso de las fuentes de luz y los filtros adecuados. Esto logra una resolución óptica efectiva varias veces mejor que la resolución óptica convencional, que está representada por la semianchura del máximo principal de la función de imagen de punto efectiva. ^{[ 78 ]}

La resolución estructural alcanzable mediante SPDM puede expresarse en términos de la distancia medible más pequeña entre dos partículas puntiformes de diferentes características espectrales ("resolución topológica"). El modelado ha demostrado que, bajo condiciones adecuadas en cuanto a la precisión de localización, la densidad de partículas, etc., la "resolución topológica" corresponde a una " frecuencia espacial " que, según la definición clásica, es equivalente a una resolución óptica mucho mayor. Las moléculas también pueden distinguirse de maneras aún más sutiles basándose en el tiempo de vida de fluorescencia y otras técnicas. ^{[ 78 ]}

Una aplicación importante se encuentra en la investigación del genoma (estudio de la organización funcional del genoma ). Otra área de uso importante es la investigación de la estructura de las membranas.

SPDMphymod

La microscopía de localización para muchos colorantes fluorescentes estándar como GFP , los colorantes Alexa Fluor y las moléculas de fluoresceína es posible si se dan ciertas condiciones fotofísicas. Con esta tecnología denominada fluoróforos físicamente modificables (SPDMphymod) , una sola longitud de onda láser de intensidad adecuada es suficiente para la nanoimagen ^{[ 81 ],} a diferencia de otras tecnologías de microscopía de localización que necesitan dos longitudes de onda láser cuando se utilizan moléculas fluorescentes especiales fotoactivables/fotoconmutables. Otro ejemplo del uso de SPDMphymod es el análisis de partículas del virus del mosaico del tabaco (TMV) ^{[ 82 ]} o el estudio de la ^interacción virus-célula ^{[ 83 , 84 ]} .

Basándose en las transiciones de estado singlete-triplete, es crucial para SPDMphymod que este proceso sea continuo y conduzca al efecto de que una sola molécula entre primero en un estado oscuro reversible de muy larga duración (con una vida media de hasta varios segundos), desde el cual regresa a un estado fluorescente que emite muchos fotones durante varios milisegundos antes de regresar a un estado oscuro irreversible de muy larga duración. La microscopía SPDMphymod utiliza moléculas fluorescentes que emiten la misma frecuencia de luz espectral, pero con diferentes firmas espectrales basadas en las características de parpadeo. Al combinar dos mil imágenes de la misma célula, es posible, mediante mediciones ópticas láser de precisión, registrar imágenes de localización con una resolución óptica significativamente mejorada. ^{[ 85 ]}

Los colorantes fluorescentes estándar que ya se utilizan con éxito con la tecnología SPDMphymod son GFP , RFP , YFP , Alexa 488 , Alexa 568, Alexa 647, Cy2 , Cy3, Atto 488 y fluoresceína .

Localización óptica criogénica en 3D (COLD)

La localización óptica criogénica en 3D (COLD) es un método que permite localizar múltiples sitios fluorescentes dentro de una sola biomolécula de tamaño pequeño a mediano con resolución a escala de Angstrom. ^{[ 57 ]} La precisión de localización en este enfoque se ve mejorada porque la fotoquímica más lenta a bajas temperaturas conduce a una mayor cantidad de fotones que pueden ser emitidos por cada fluoróforo antes del fotoblanqueo. ^{[ 86 ] [ 87 ]} En consecuencia, la microscopía de localización estocástica criogénica alcanza la resolución submolecular necesaria para resolver las posiciones 3D de varios fluoróforos unidos a una proteína pequeña. Al emplear algoritmos conocidos de la microscopía electrónica, las proyecciones 2D de los fluoróforos se reconstruyen en una configuración 3D. COLD lleva la microscopía de fluorescencia a su límite fundamental, dependiendo del tamaño del marcador. Este método también puede combinarse con otras técnicas de biología estructural, como la cristalografía de rayos X, la espectroscopia de resonancia magnética y la microscopía electrónica, para proporcionar información complementaria valiosa y mayor especificidad.

Microscopía de localización activada por unión (BALM)

La microscopía de localización activada por unión (BALM) es un concepto general para la microscopía de localización de molécula única (SMLM): imágenes de superresolución de colorantes que se unen al ADN basadas en la modificación de las propiedades del ADN y un colorante. ^{[ 88 ]} Mediante un ajuste cuidadoso del entorno químico, que conduce a la fusión local y reversible del ADN y al control de la hibridación sobre la señal de fluorescencia, se pueden introducir moléculas de colorante que se unen al ADN. Los colorantes de ADN intercalantes y que se unen al surco menor se pueden utilizar para registrar y aislar ópticamente solo unas pocas señales de colorante que se unen al ADN a la vez. La BALM asistida por fluctuación de la estructura del ADN (fBALM) se ha utilizado para nanoescala diferencias en la arquitectura nuclear, con una resolución estructural prevista de aproximadamente 50  nm. Imágenes de la nanoestructura de la cromatina con microscopía de localización activada por unión basada en fluctuaciones de la estructura del ADN. ^{[ 89 ]} Recientemente, el aumento significativo del rendimiento cuántico de fluorescencia de NIAD-4 al unirse a un amiloide se aprovechó para la obtención de imágenes BALM de fibrillas amiloides ^{[ 90 ]} y oligómeros. ^{[ 91 ]}

Microscopía de localización sin marcadores

Mediante la microscopía de localización SPDM , se puede lograr una resolución óptica de las estructuras celulares en el rango de aproximadamente 50  nm, incluso en células sin marcadores.

Mediante el uso de dos longitudes de onda láser diferentes, la técnica SPDM revela objetos celulares que no son detectables en las condiciones convencionales de imagen de fluorescencia de campo amplio, además de lograr una mejora sustancial en la resolución de las estructuras autofluorescentes.

Como control, las posiciones de los objetos detectados en la imagen de localización coinciden con las de la imagen de campo claro. ^{[ 104 ]}

También se ha demostrado la microscopía de superresolución sin marcadores utilizando las fluctuaciones de una señal de dispersión Raman mejorada en superficie sobre una metasuperficie plasmónica altamente uniforme. ^{[ 105 ]}

La microscopía de iluminación aleatoria (RIM) es una técnica de imagen de superresolución que emplea iluminaciones de campo amplio, aleatorias o pseudoaleatorias, generadas por un láser. Este método permite reconstruir una imagen de alta resolución a partir de múltiples fotogramas de baja resolución capturados bajo patrones de iluminación variables y desconocidos, alcanzando resoluciones de hasta 90 nanómetros. La RIM resulta especialmente ventajosa para la obtención de imágenes de muestras vivas y gruesas debido a su mínima fototoxicidad y a su robusta capacidad de seccionamiento en el eje z. Además, su resistencia a las aberraciones ópticas la convierte en una herramienta muy eficaz para la investigación biológica.

Es posible evitar la necesidad de ajustar la función de dispersión puntual (PSF) inherente a la microscopía de localización de molécula única (SMLM) calculando directamente la autocorrelación temporal de los píxeles. Esta técnica se denomina imagen de fluctuación óptica de superresolución (SOFI) y ha demostrado ser más precisa que la SMLM cuando la densidad de fluoróforos activos simultáneamente es muy alta.

La microscopía de localización omnipresente (OLM) es una extensión de las técnicas de microscopía de molécula única (SMLM) que permite la obtención de imágenes de moléculas únicas de alta densidad con una fuente de luz incoherente (como una lámpara de arco de mercurio) y una configuración de microscopio de epifluorescencia convencional. ^{[ 113 ]} Un breve pulso de excitación azul profundo (con un láser de 350-380  nm, en lugar de uno de 405  nm) permite una reactivación prolongada de las moléculas, para una resolución de 90  nm en las muestras de prueba. Finalmente, se puede realizar la obtención de imágenes correlativas STED y SMLM en la misma muestra biológica utilizando un medio de imagen simple, lo que puede proporcionar una base para una resolución aún mayor. Estos hallazgos pueden democratizar la obtención de imágenes de superresolución y ayudar a cualquier científico a generar imágenes de moléculas únicas de alta densidad incluso con un presupuesto limitado.

La mejora de la resolución mediante imágenes secuenciales (RESI) es una extensión de DNA-PAINT que puede alcanzar una resolución teóricamente ilimitada. ^{[ 114 ]} En lugar de utilizar un tipo de etiqueta para identificar una especie objetivo determinada, se etiquetan copias del mismo objetivo con secuencias de ADN ortogonales. Mediante imágenes secuenciales (es decir, separadas), las nubes de localización que se superpondrían en SMLM convencional pueden (1) resolverse y (2) combinarse en una única "superlocalización", cuya precisión aumenta con el número de localizaciones subyacentes. Dado que el número de localizaciones alcanzables en DNA-PAINT es ilimitado, también lo es la resolución teórica de RESI. La superposición de las localizaciones RESI de las rondas de imágenes subyacentes crea una imagen compuesta de alta resolución.

Las imágenes de microscopía de nanodimensionamiento por microscopía óptica (3D LIMON), utilizando el microscopio Vertico SMI , son posibles gracias a la combinación de SMI y SPDM , en la que primero se aplica el proceso SMI y luego el SPDM.

El proceso SMI determina el centro de las partículas y su dispersión en la dirección del eje del microscopio. Si bien el centro de las partículas/moléculas se puede determinar con una precisión de 1 a 2  nm, la dispersión alrededor de este punto se puede determinar hasta un diámetro axial de aproximadamente 30 a 40  nm.

Posteriormente, la posición lateral de la partícula/molécula individual se determina utilizando SPDM, logrando una precisión de unos pocos nanómetros. ^{[ 115 ]}

Como aplicación biológica en el modo de doble color 3D, se logró la disposición espacial de los cúmulos de Her2/neu y Her3 . Las posiciones en las tres direcciones de los cúmulos de proteínas pudieron determinarse con una precisión de aproximadamente 25  nm. ^{[ 116 ]}

La combinación de un microscopio de superresolución con un microscopio electrónico permite visualizar información contextual, con el etiquetado proporcionado por marcadores fluorescentes. Esto supera el problema del fondo negro que queda cuando el investigador utiliza solo un microscopio óptico. En un sistema integrado, la muestra se mide con ambos microscopios simultáneamente. ^{[ 117 ]}

La técnica de imagen SR-FACT combina la superresolución y la tomografía computacional de difracción asistida. Esta técnica posee capacidades únicas aplicables a la biología celular , particularmente centradas en el interactoma celular . ^{[ 118 ]}