RESOLVER

RESOLFT , acrónimo de Transiciones de Fluorescencia Óptica Saturables Reversibles , designa un grupo de técnicas de microscopía de fluorescencia óptica de muy alta resolución. Mediante óptica estándar de luz visible de campo lejano, se puede obtener una resolución muy inferior al límite de difracción, hasta escalas moleculares.

Con las técnicas de microscopía convencionales , no es posible distinguir estructuras situadas a distancias inferiores a la mitad de la longitud de onda utilizada (es decir, unos 200 nm para la luz visible ). Este límite de difracción se basa en la naturaleza ondulatoria de la luz . En los microscopios convencionales, el límite está determinado por la longitud de onda utilizada y la apertura numérica del sistema óptico. El concepto RESOLFT supera este límite al cambiar temporalmente las moléculas a un estado en el que no pueden emitir una señal (de fluorescencia) al ser iluminadas. Este concepto difiere, por ejemplo, de la microscopía electrónica, donde la longitud de onda utilizada es mucho menor.

La microscopía RESOLFT es una microscopía óptica de muy alta resolución que permite visualizar detalles en muestras que no pueden ser observados con microscopía convencional o confocal . En RESOLFT se generalizan los principios de la microscopía STED ^{[ 1 ] [ 2 ]} y la microscopía GSD . Las estructuras que normalmente están demasiado cerca unas de otras para ser distinguidas se leen secuencialmente.

Dentro de este marco, se pueden explicar todos los métodos que operan sobre moléculas que tienen al menos dos estados distinguibles, donde es posible la conmutación reversible entre los dos estados, y donde al menos una de dichas transiciones puede ser inducida ópticamente.

En la mayoría de los casos se utilizan marcadores fluorescentes, donde un estado (A) es brillante, es decir, genera una señal de fluorescencia, y el otro estado (B) es oscuro y no produce ninguna señal. Se puede inducir una transición entre ellos mediante luz (por ejemplo, de A a B, de brillante a oscuro).

La muestra se ilumina de forma no homogénea, con una intensidad de iluminación muy pequeña (cero en condiciones ideales) en una posición. Solo en este punto las moléculas nunca se encuentran en el estado oscuro B (si A es el estado preexistente) y permanecen completamente en el estado brillante A. El área donde las moléculas se encuentran mayoritariamente en el estado brillante puede reducirse considerablemente (hasta un nivel inferior al límite de difracción convencional) aumentando la intensidad de la luz de transición (véase más adelante). Por lo tanto, se sabe que cualquier señal detectada proviene únicamente de las moléculas en la pequeña área alrededor del mínimo de intensidad de iluminación. Se puede construir una imagen de alta resolución escaneando la muestra, es decir, desplazando el perfil de iluminación a través de la superficie. ^{[ 3 ]}

La transición de B a A puede ser espontánea o inducida por luz de otra longitud de onda. Las moléculas deben poder conmutarse varias veces para estar presentes en el estado A o B en distintos momentos durante el escaneo de la muestra. El método también funciona si se invierten los estados brillante y oscuro, obteniéndose así una imagen negativa.

En RESOLFT, el área donde residen las moléculas en el estado A (estado brillante) puede hacerse arbitrariamente pequeña a pesar del límite de difracción.

• Es necesario iluminar la muestra de forma no homogénea para crear un punto aislado de intensidad cero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante interferencia.
• A bajas intensidades (inferiores a la línea azul de la imagen), la mayoría de las moléculas marcadoras se encuentran en estado brillante; si la intensidad es superior, la mayoría de los marcadores se encuentran en estado oscuro.

Con una iluminación débil, observamos que el área donde las moléculas permanecen en el estado A sigue siendo bastante grande, ya que la iluminación es tan baja que la mayoría de las moléculas se encuentran en dicho estado. No es necesario modificar el perfil de iluminación. Al aumentar la intensidad de la iluminación, se reduce el área donde la intensidad es inferior a la necesaria para una transición eficiente al estado oscuro. En consecuencia, también disminuye el área donde las moléculas pueden permanecer en el estado A. La señal (de fluorescencia) durante una lectura posterior se origina en un punto muy pequeño, lo que permite obtener imágenes muy nítidas.

En el concepto RESOLFT, la resolución se puede aproximar mediante , donde es la intensidad característica requerida para saturar la transición (la mitad de las moléculas permanecen en el estado A y la otra mitad en el estado B), y denota la intensidad aplicada. Si los mínimos se producen al enfocar ópticas con una apertura numérica , la distancia mínima a la que se pueden discernir dos objetos idénticos es , que puede considerarse una extensión de la ecuación de Abbe . La naturaleza sin límite de difracción de la familia de conceptos RESOLFT se refleja en el hecho de que la distancia mínima resoluble puede disminuirse continuamente al aumentar . Por lo tanto, la búsqueda de la resolución a nanoescala se reduce a maximizar esta cantidad. Esto es posible aumentando o disminuyendo . ${\displaystyle \Delta d\simeq {\frac {\lambda }{\pi n{\sqrt {\frac {I}{Isat}}}}}}$${\displaystyle I_{sat}}$${\displaystyle I}$${\displaystyle {\mbox{NA}}=n\sin \alpha }$${\displaystyle \Delta d={\frac {\lambda }{2n\cdot \sin \alpha \cdot {\sqrt {1+{\frac {I}{Isat}}}}}}}$${\displaystyle \Delta d}$${\displaystyle \varsigma ={\frac {I}{Isat}}}$${\displaystyle I}$${\displaystyle I_{sat}}$

Se utilizan diferentes procesos para cambiar los estados moleculares. Sin embargo, todos tienen en común que se emplean al menos dos estados distinguibles. Normalmente, la propiedad de fluorescencia utilizada marca la distinción entre los estados; sin embargo, esto no es esencial, ya que también se pueden aprovechar las propiedades de absorción o dispersión. ^{[ 4 ]}

En la microscopía STED (microscopía de agotamiento por emisión estimulada) ^{[ 1 ] [ 2 ],} una molécula de colorante fluorescente se desplaza entre su estado fundamental electrónico y su estado excitado , emitiendo fotones de fluorescencia. Este es el modo de operación estándar en la microscopía de fluorescencia y representa el estado A. En el estado B, el colorante se mantiene permanentemente en su estado fundamental electrónico mediante emisión estimulada . Si el colorante puede fluorescer en el estado A pero no en el estado B, se aplica el concepto RESOLFT.

La microscopía GSD (microscopía de agotamiento del estado fundamental) también utiliza marcadores fluorescentes. En el estado A, la molécula puede oscilar libremente entre el estado fundamental y el primer estado excitado, emitiendo fluorescencia. En el estado oscuro B, el estado fundamental de la molécula se despobla, produciéndose una transición a un estado excitado de larga duración desde el cual no se emite fluorescencia. Mientras la molécula se encuentra en el estado oscuro, no puede alternar entre el estado fundamental y el estado excitado, por lo que la fluorescencia se desactiva.

La microscopía de excitación de patrones saturados (SPEM) ^{[ 5 ]} y la microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM) ^{[ 6 ]} aprovechan el concepto RESOLFT, utilizando excitación saturada para producir imágenes "negativas", es decir, la fluorescencia se produce en todas partes excepto en una región muy pequeña alrededor del foco geométrico del microscopio. Además, se utilizan patrones no puntuales para la iluminación. La reconstrucción matemática de la imagen es necesaria para obtener imágenes positivas.

Algunas proteínas fluorescentes pueden activarse y desactivarse mediante luz de una longitud de onda adecuada. Se pueden utilizar en un microscopio tipo RESOLFT. ^{[ 7 ]} Durante la iluminación, estas proteínas cambian su conformación. En este proceso, adquieren o pierden su capacidad de emitir fluorescencia. El estado fluorescente corresponde al estado A, el no fluorescente al estado B, y el concepto RESOLFT se aplica nuevamente. La transición reversible (por ejemplo, de B a A) se produce de forma espontánea o inducida por la luz. La inducción de cambios conformacionales en las proteínas se puede lograr con intensidades de luz de conmutación mucho menores en comparación con la emisión estimulada o el agotamiento del estado fundamental (algunos W/cm² ⁾ . En combinación con la microscopía 4Pi , se han obtenido imágenes de células vivas con una resolución isotrópica inferior a 40 nm a bajos niveles de luz. ^{[ 8 ]}

Al igual que las proteínas, algunos colorantes orgánicos también pueden cambiar su estructura al ser iluminados. ^{[ 9 ] [ 10 ]} La capacidad de fluorescencia de estos colorantes orgánicos se puede activar y desactivar mediante luz visible. Nuevamente, las intensidades de luz aplicadas pueden ser bastante bajas (unos 100 W/cm ² ).