Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Microscopía de plano multifocal

Esquema de un microscopio de plano multifocal La microscopía de plano multifocal ( MUM ), también conocida como microscopía multiplanar o microscopía multifocal , es una forma d...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita

Esquema de un microscopio de plano multifocal

La microscopía de plano multifocal ( MUM ), también conocida como microscopía multiplanar o microscopía multifocal , es una forma de microscopía óptica que permite el seguimiento de la dinámica 3D en células vivas con alta resolución temporal y espacial mediante la obtención simultánea de imágenes de diferentes planos focales dentro de la muestra. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] En esta metodología, la luz recogida de la muestra por una lente objetivo corregida al infinito se divide en dos trayectorias. [ 5 ] En cada trayectoria, la luz dividida se enfoca en un detector que se coloca a una distancia específica calibrada de la lente del tubo. De esta manera, cada detector obtiene una imagen de un plano distinto dentro de la muestra. El primer sistema MUM desarrollado era capaz de obtener imágenes de dos planos distintos dentro de la muestra. Sin embargo, el sistema se puede modificar para obtener imágenes de más de dos planos dividiendo aún más la luz en cada trayectoria y enfocándola en detectores colocados a distancias específicas calibradas. Posteriormente se ha mejorado para obtener imágenes de hasta cuatro planos distintos. [ 6 ] [ 7 ] Para obtener imágenes de un mayor número de planos focales, se han desarrollado técnicas más sencillas basadas en óptica de división de imágenes. Un ejemplo es el uso de un prisma divisor de imágenes personalizado, capaz de capturar hasta 8 planos focales con solo dos cámaras. [ 8 ] Mejor aún, se pueden usar divisores de haz parciales estándar disponibles en el mercado para construir un prisma denominado divisor z, que permite la obtención de imágenes simultáneas de 9 planos focales individuales con una sola cámara. [ 9 ] [ 10 ] Otra técnica, denominada microscopía multifocal (MFM), utiliza óptica difractiva de Fourier para obtener imágenes de hasta 25 planos focales. [ 11 ] [ 12 ]

Introducción

La microscopía de fluorescencia de células vivas constituye una herramienta fundamental para el estudio de los procesos de transporte intracelular. El diseño convencional del microscopio permite visualizar la dinámica celular rápida en dos dimensiones, es decir, en el plano focal. Sin embargo, las células son objetos tridimensionales y las vías de transporte intracelular no suelen estar restringidas a un único plano focal. Si la dinámica no se limita a un plano focal, la microscopía convencional de un solo plano resulta insuficiente para estudios detallados de la dinámica intracelular rápida en tres dimensiones. Los métodos clásicos basados ​​en el cambio del plano focal a menudo no son eficaces en estas situaciones, ya que los dispositivos de enfoque son relativamente lentos en comparación con la velocidad de muchos procesos intracelulares. Además, el plano focal puede encontrarse frecuentemente en el lugar y momento incorrectos, lo que conlleva la pérdida de aspectos importantes de los procesos dinámicos.

Implementación

MUM se puede implementar en cualquier microscopio óptico estándar . Un ejemplo de implementación en un microscopio Zeiss es el siguiente: [ 13 ] Primero, se conecta un adaptador de vídeo dual Zeiss al puerto lateral de un microscopio Zeiss Axiovert 200. Luego, se concatenan dos adaptadores de vídeo dual Zeiss conectando cada uno de ellos a los puertos de salida del primer adaptador de vídeo Zeiss. A cada uno de los adaptadores de vídeo concatenados, se le acopla una cámara CCD de alta resolución mediante anillos espaciadores/montura C y un adaptador de acoplamiento de cámara mecanizado a medida. El espaciado entre el puerto de salida del adaptador de vídeo y la cámara es diferente para cada cámara, lo que da como resultado que las cámaras capturen imágenes de planos focales distintos.

Cabe mencionar que existen muchas formas de implementar MUM. La implementación mencionada ofrece varias ventajas, como flexibilidad, facilidad de instalación y mantenimiento, y adaptabilidad a diferentes configuraciones. Además, para diversas aplicaciones es importante poder adquirir imágenes en diferentes colores con distintos tiempos de exposición . Por ejemplo, para visualizar la exocitosis en TIRFM , se requiere una adquisición muy rápida. Sin embargo, para obtener imágenes de un orgánulo estacionario marcado con fluorescencia en la célula, se necesita una baja excitación para evitar el fotoblanqueo y, como resultado, la adquisición debe ser relativamente lenta. [ 14 ] En este sentido, la implementación anterior ofrece una gran flexibilidad, ya que se pueden utilizar diferentes cámaras para adquirir imágenes en distintos canales.

Imágenes de superresolución 3D y seguimiento de moléculas individuales mediante MUM.

Comparación de la discriminación de profundidad de MUM con la microscopía convencional de plano único.

Las técnicas modernas de microscopía han generado un gran interés en el estudio de los procesos celulares a nivel de molécula individual. Los experimentos con moléculas individuales superan los efectos de promediado y, por lo tanto, proporcionan información inaccesible mediante estudios convencionales a granel. Sin embargo, la localización y el seguimiento tridimensional de moléculas individuales plantean varios desafíos. Además de la cuestión de si se pueden capturar imágenes de la molécula individual mientras experimenta una dinámica tridimensional potencialmente muy compleja, surge la pregunta de si se puede determinar la ubicación tridimensional de la molécula individual y con qué precisión.

Un obstáculo importante para la estimación de la ubicación 3D de alta precisión es la escasa discriminación de profundidad de un microscopio estándar. [ 15 ] Incluso con un objetivo de alta apertura numérica , la imagen de una fuente puntual en un microscopio convencional no cambia apreciablemente si la fuente puntual se desplaza varios cientos de nanómetros desde su posición focal. Esto hace que sea extraordinariamente difícil determinar la posición axial, es decir, la posición z, de la fuente puntual con un microscopio convencional.

En términos más generales, la microscopía cuantitativa de molécula única para muestras 3D plantea el mismo problema, ya sea que la aplicación sea de localización/seguimiento o de microscopía de superresolución como PALM, STORM, FPALM, dSTORM para aplicaciones 3D, es decir, la determinación de la ubicación de una sola molécula en tres dimensiones. [ 16 ] MUM ofrece varias ventajas. [ 17 ] En MUM, las imágenes de la fuente puntual se adquieren simultáneamente en diferentes niveles de enfoque. Estas imágenes proporcionan información adicional que puede usarse para restringir la posición z de la fuente puntual. Esta información de restricción supera en gran medida el problema de discriminación de profundidad cerca del foco.

La medida de localización 3D proporciona una medida cuantitativa de la precisión con la que se puede determinar la ubicación de la fuente puntual . Un valor numérico pequeño de la medida de localización 3D implica una precisión muy alta en la determinación de la ubicación, mientras que un valor numérico grande implica una precisión muy baja. En un microscopio convencional, cuando la fuente puntual está cerca del plano focal, por ejemplo, z0 ≤ 250  nm, la medida de localización 3D predice una precisión muy baja en la estimación de la posición z. Por lo tanto, en un microscopio convencional, resulta problemático realizar un seguimiento 3D cuando la fuente puntual está cerca del plano focal.

Por otro lado, para una configuración MUM de dos planos, la medida de localización 3D predice una precisión consistentemente mejor que un microscopio convencional para un rango de valores z, especialmente cuando la fuente puntual está cerca del plano de enfoque. Una implicación inmediata de este resultado es que la ubicación z de la fuente puntual se puede determinar con un nivel de precisión relativamente similar para un rango de valores z, lo cual es favorable para el seguimiento de partículas individuales en 3D .

Microscopía de plano multifocal de doble objetivo (dMUM)

Microscopio de plano multifocal de doble objetivo (dMUM)

En las aplicaciones de imagen de partículas individuales, el número de fotones detectados por la etiqueta fluorescente desempeña un papel crucial en el análisis cuantitativo de los datos adquiridos. Actualmente, los experimentos de seguimiento de partículas se realizan típicamente en un microscopio invertido o vertical, en el que una sola lente objetivo ilumina la muestra y también recoge la señal de fluorescencia. Cabe destacar que, si bien la emisión de fluorescencia de la muestra se produce en todas las direcciones (es decir, por encima y por debajo de la muestra), el uso de una sola lente objetivo en estas configuraciones de microscopio da como resultado la recogida de luz de un solo lado de la muestra. Incluso si se utiliza una lente objetivo de alta apertura numérica, no todos los fotones emitidos en un lado de la muestra pueden ser recogidos debido al ángulo de recogida finito de la lente objetivo. Por lo tanto, incluso en las mejores condiciones de imagen, los microscopios convencionales recogen solo una fracción de los fotones emitidos por la muestra.

Para abordar este problema, se puede utilizar una configuración de microscopio que emplea dos lentes objetivo opuestas, donde una de ellas se encuentra en posición invertida y la otra en posición vertical. Esta configuración se denomina microscopía de plano multifocal de doble objetivo (dMUM). [ 18 ]

Referencias

  1. ↑ Prabhat, P.; Ram, S.; Ward, ES; Ober, RJ (2004). "Imágenes simultáneas de diferentes planos focales en microscopía de fluorescencia para el estudio de la dinámica celular en tres dimensiones" . IEEE Transactions on NanoBioscience . 3 (4): 237– 242. doi : 10.1109/TNB.2004.837899 . PMC 2761735. PMID 15631134 .  
  2. ↑ Prabhat, P.; Ram, S.; Ward, ES; Ober, RJ (2006). Conchello, Jose-Angel; Cogswell, Carol J; Wilson, Tony (eds.). "Imágenes simultáneas de varios planos focales en microscopía de fluorescencia para el estudio de la dinámica celular en 3D". Actas de SPIE . Microscopía tridimensional y multidimensional: adquisición y procesamiento de imágenes XIII. 6090 : 115–121 . Bibcode : 2006SPIE.6090..115P . doi : 10.1117/12.644343 . S2CID 119772837 . 
  3. ↑ Dehmelt, Leif; Bastiaens, Philippe IH (2010). "Organización espacial de la comunicación intracelular: perspectivas a partir de imágenes". Nature Reviews Molecular Cell Biology . 11 (6): 440– 452. doi : 10.1038/nrm2903 . PMID 20485292 . S2CID 12262683 .  
  4. ↑ Tahmasbi, A.; Ram, S.; Chao, J.; Abraham, AV; Tang, FW; Ward, ES; Ober, RJ (2014). " Diseño del espaciado del plano focal para microscopía de plano multifocal" . Optics Express . 22 (14): 16706– 16721. Bibcode : 2014OExpr..2216706T . doi : 10.1364/OE.22.016706 . PMC 4162350. PMID 25090489 .  
  5. ↑ Badieirostami, M.; Lew, MD; Thompson, MA; Moerner, WE (2010). "Precisión de localización tridimensional de la función de dispersión de punto de doble hélice frente al astigmatismo y el biplano" . Applied Physics Letters . 97 (16): 161103. Bibcode : 2010ApPhL..97p1103B . doi : 10.1063/1.3499652 . PMC 2980550. PMID 21079725 .  
  6. ↑ Ram, Sripad; Prabhat, Prashant; Chao, Jerry; Sally Ward, E.; Ober, Raimund J. (2008). "Seguimiento de puntos cuánticos 3D de alta precisión con microscopía de plano multifocal para el estudio de la dinámica intracelular rápida en células vivas" . Biophysical Journal . 95 (12): 6025– 6043. Bibcode : 2008BpJ....95.6025R . doi : 10.1529/biophysj.108.140392 . PMC 2599831. PMID 18835896 .  
  7. ↑ Dalgarno, PA; Dalgarno, HIC; Putoud, A.; Lambert, R.; Paterson, L.; Logan, DC; Towers, DP; Warburton, RJ; Greenaway, AH (2010). "Imágenes multiplanares y seguimiento tridimensional de partículas a nanoescala en microscopía biológica" . Optics Express . 18 (2): 877– 884. Bibcode : 2010OExpr..18..877D . doi : 10.1364/OE.18.000877 . PMID 20173908. S2CID 7701295 .  
  8. ^ Geissbühler, S.; Sharipov, A.; Godinat, A.; Bocchio, NL; Sandoz, Pensilvania; Huss, A.; Jensen, NA; Jacobs, S.; Enderlein, J.; Goot, FG; Dubikovskaya, EA; Lasser, T.; Leutenegger, M. (2014). "Imágenes de fluctuación óptica de superresolución tridimensional multiplano de células vivas" . Comunicaciones de la naturaleza . 5 : 5830. Código Bib : 2014NatCo...5.5830G . doi : 10.1038/ncomms6830 . PMC 4284648 . PMID 25518894 .  
  9. ↑ Xiao, S.; Gritton, H.; Tseng, H.-A.; Zemel, D.; Han, X.; Mertz, J. (2020). "Microscopía multifocal de alto contraste con una sola cámara y prisma divisor z" . Optica . 7 (11): 1477– 1486. ​​Bibcode : 2020Optic...7.1477X . doi : 10.1364/OPTICA.404678 . PMC 8443084. PMID 34532564 .  
  10. ↑ Xiao, S.; Zheng, S.; Mertz, J. (2021). "Imágenes de fase multifocales de alta velocidad en tejido grueso" . Biomedical Optics Express . 12 (9): 5782– 5792. doi : 10.1364/BOE.436247 . PMC 8515987. PMID 34692215 .  
  11. ↑ Abrahamsson, Sara; Chen, Jiji; Hajj, Bassam; Stallinga, Sjoerd; Katsov, Alexander Y; Wisniewski, Jan; Mizuguchi, Gaku; Soule, Pierre; Mueller, Florian (1 de enero de 2012). "Imágenes 3D multicolor rápidas mediante microscopía multifocal con corrección de aberraciones" . Nature Methods . 10 (1): 60– 63. doi : 10.1038/nmeth.2277 . PMC 4161287. PMID 23223154 .  
  12. ↑ Abrahamsson, Sara; McQuilken, Molly; Mehta, Shalin B.; Verma, Amitabh; Larsch, Johannes; Ilic, Rob; Heintzmann, Rainer; Bargmann, Cornelia I.; Gladfelter, Amy S. (1 de enero de 2015). "Microscopio de polarización multifocal (MF-PolScope) para imágenes de polarización 3D de hasta 25 planos focales simultáneamente" . Optics Express . 23 (6): 7734– 7754. Bibcode : 2015OExpr..23.7734A . doi : 10.1364/oe.23.007734 . PMC 5802244. PMID 25837112 .  
  13. ↑ "MUM – Laboratorio Ward Ober" . UT Southwestern . Consultado el 19 de julio de 2012 .
  14. ↑ Prabhat, P.; Gan, Z.; Chao, J.; Ram, S.; Vaccaro, C.; Gibbons, S.; Ober, RJ; Ward, ES (2007). "Elucidación de las vías de reciclaje intracelular que conducen a la exocitosis del receptor Fc, FcRn, mediante microscopía de plano multifocal" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 104 (14): 5889– 5894. Bibcode : 2007PNAS..104.5889P . doi : 10.1073/pnas.0700337104 . PMC 1851587. PMID 17384151 .  
  15. ↑ Ram, S.; Ward, ES; Ober, RJ (2005). Nicolau, Dan V; Enderlein, Joerg; Leif, Robert C; Farkas, Daniel L; Raghavachari, Ramesh (eds.). "¿Con qué precisión se puede localizar una sola molécula en tres dimensiones utilizando un microscopio de fluorescencia?" . Actas de SPIE . Imágenes, manipulación y análisis de biomoléculas y células: fundamentos y aplicaciones III. 5699 : 426– 435. Bibcode : 2005SPIE.5699..426R . doi : 10.1117/12.587878 . PMC 2864488 . PMID 20448826 .  
  16. ↑ "Microscopio de superresolución FPALM biplano" .
  17. ↑ Ram, Sripad; Chao, Jerry; Prabhat, Prashant; Ward, E. Sally; Ober, Raimund J. (2007). Conchello, Jose-Angel; Cogswell, Carol J; Wilson, Tony (eds.). "Un nuevo enfoque para determinar la ubicación tridimensional de objetos microscópicos con aplicaciones al seguimiento de partículas 3D". Actas de SPIE . Microscopía tridimensional y multidimensional: adquisición y procesamiento de imágenes XIV. 6443 : 6443–0C. Bibcode : 2007SPIE.6443E..0DR . doi : 10.1117/12.698763 . S2CID 121283489 . 
  18. ↑ Ram, Sripad; Prabhat, Prashant; Ward, E. Sally; Ober, Raimund J. (2009). "Mejora de la precisión de localización de partículas individuales con microscopía de plano multifocal de doble objetivo" . Optics Express . 17 (8): 6881– 6898. Bibcode : 2009OExpr..17.6881R . doi : 10.1364/OE.17.006881 . PMC 2720637. PMID 19365515 .