micromatriz de ADN

Los microarrays se pueden fabricar de diferentes maneras, según la cantidad de sondas que se analicen, los costos, los requisitos de personalización y el tipo de pregunta científica que se plantee. Los microarrays de proveedores comerciales pueden contener desde tan solo 10 sondas hasta 5 millones o más de sondas a escala micrométrica.

Los microarrays se pueden fabricar utilizando una variedad de tecnologías, incluyendo la impresión con alfileres de punta fina sobre portaobjetos de vidrio, fotolitografía utilizando máscaras prefabricadas, fotolitografía utilizando dispositivos de micromirrores dinámicos, impresión por inyección de tinta, ^{[ 11 ] [ 12 ]} o electroquímica en matrices de microelectrodos.

En los microarrays de puntos , las sondas son oligonucleótidos , ADNc o pequeños fragmentos de productos de PCR que corresponden a ARNm . Las sondas se sintetizan antes de depositarlas sobre la superficie del microarray y luego se depositan sobre vidrio. Un método común utiliza una matriz de agujas finas controladas por un brazo robótico que se sumerge en pocillos que contienen sondas de ADN y luego deposita cada sonda en ubicaciones designadas en la superficie del microarray. La cuadrícula resultante de sondas representa los perfiles de ácidos nucleicos de las sondas preparadas y está lista para recibir secuencias complementarias de ADNc o ARNc derivadas de muestras experimentales o clínicas. Esta técnica es utilizada por investigadores de todo el mundo para producir microarrays impresos en sus propios laboratorios. Estos microarrays se pueden personalizar fácilmente para cada experimento, ya que los investigadores pueden elegir las sondas y las ubicaciones de impresión, sintetizar las sondas en su propio laboratorio (o en un centro colaborador) y depositarlas en los microarrays. Luego, pueden generar sus propias muestras etiquetadas para hibridación, hibridar las muestras en el microarreglo y, finalmente, escanear los microarreglos con su propio equipo. Esto proporciona un microarreglo de costo relativamente bajo que puede personalizarse para cada estudio y evita los costos de adquirir microarreglos comerciales, a menudo más caros, que pueden representar una gran cantidad de genes que no son de interés para el investigador. Existen publicaciones que indican que los microarreglos impresos internamente pueden no proporcionar el mismo nivel de sensibilidad en comparación con los microarreglos de oligonucleótidos comerciales, ^{[ 13 ]} posiblemente debido a los tamaños de lote pequeños y las eficiencias de impresión reducidas en comparación con los fabricantes industriales de microarreglos de oligonucleótidos.

En los microarrays de oligonucleótidos , las sondas son secuencias cortas diseñadas para coincidir con partes de la secuencia de marcos de lectura abiertos conocidos o predichos . Aunque las sondas de oligonucleótidos se utilizan a menudo en microarrays "impresos", el término "array de oligonucleótidos" se refiere con mayor frecuencia a una técnica de fabricación específica. Los microarrays de oligonucleótidos se producen imprimiendo secuencias cortas de oligonucleótidos diseñadas para representar un solo gen o una familia de variantes de empalme de genes, sintetizando esta secuencia directamente sobre la superficie del microarray en lugar de depositar secuencias intactas. Las secuencias pueden ser más largas (sondas de 60 nucleótidos como el diseño de Agilent ) o más cortas (sondas de 25 nucleótidos producidas por Affymetrix ) según el propósito deseado; las sondas más largas son más específicas para genes diana individuales, mientras que las sondas más cortas se pueden imprimir con mayor densidad en todo el microarray y son más económicas de fabricar. Una técnica utilizada para producir matrices de oligonucleótidos incluye la síntesis fotolitográfica (Affymetrix) sobre un sustrato de sílice, donde se utilizan luz y agentes de enmascaramiento fotosensibles para "construir" una secuencia nucleótido a nucleótido a lo largo de toda la matriz. ^{[ 14 ]} Cada sonda aplicable se "desenmascara" selectivamente antes de sumergir la matriz en una solución de un solo nucleótido; luego, se produce una reacción de enmascaramiento y se desenmascara el siguiente conjunto de sondas para prepararlas para una exposición a un nucleótido diferente. Después de muchas repeticiones, las secuencias de cada sonda se construyen completamente. Más recientemente, la síntesis de matrices sin máscara de NimbleGen Systems ha combinado flexibilidad con un gran número de sondas. ^{[ 15 ]}

Los microarrays de dos colores o de dos canales se hibridan típicamente con ADNc preparado a partir de dos muestras que se comparan (por ejemplo, tejido enfermo frente a tejido sano) y que se marcan con dos fluoróforos diferentes . ^{[ 16 ]} Los colorantes fluorescentes comúnmente utilizados para el marcaje de ADNc incluyen Cy 3, que tiene una longitud de onda de emisión de fluorescencia de 570  nm (correspondiente a la parte verde del espectro de luz), y Cy 5 con una longitud de onda de emisión de fluorescencia de 670  nm (correspondiente a la parte roja del espectro de luz). Las dos muestras de ADNc marcadas con Cy se mezclan y se hibridan en un único microarray que luego se escanea en un escáner de microarrays para visualizar la fluorescencia de los dos fluoróforos después de la excitación con un haz láser de una longitud de onda definida. Las intensidades relativas de cada fluoróforo se pueden utilizar en un análisis basado en proporciones para identificar genes regulados al alza y a la baja. ^{[ 17 ]}

Los microarrays de oligonucleótidos suelen contener sondas de control diseñadas para hibridar con ARN de control . El grado de hibridación entre los ARN de control y las sondas de control se utiliza para normalizar las mediciones de hibridación de las sondas objetivo. Aunque en raras ocasiones se pueden determinar los niveles absolutos de expresión génica en el microarray de dos colores, las diferencias relativas de expresión entre diferentes puntos dentro de una muestra y entre muestras constituyen el método preferido de análisis de datos para el sistema de dos colores. Algunos ejemplos de proveedores de este tipo de microarrays son Agilent con su plataforma Dual-Mode, Eppendorf con su plataforma DualChip para el marcaje colorimétrico Silverquant y TeleChem International con Arrayit .

En los microarrays de un solo canal o de un solo color , estos proporcionan datos de intensidad para cada sonda o conjunto de sondas, indicando un nivel relativo de hibridación con la secuencia diana marcada. Sin embargo, no indican realmente los niveles de abundancia de un gen, sino su abundancia relativa en comparación con otras muestras o condiciones procesadas en el mismo experimento. Cada molécula de ARN se ve afectada por sesgos específicos del protocolo y del lote durante las fases de amplificación, marcaje e hibridación del experimento, lo que hace que las comparaciones entre genes del mismo microarray no sean informativas. La comparación de dos condiciones para el mismo gen requiere dos hibridaciones separadas con un solo colorante. Algunos sistemas populares de un solo canal son el Affymetrix "Gene Chip", el Illumina "Bead Chip", los microarrays de un solo canal de Agilent, los microarrays "CodeLink" de Applied Microarrays y el Eppendorf "DualChip & Silverquant". Una de las ventajas del sistema de un solo colorante reside en que una muestra anómala no puede afectar a los datos brutos obtenidos de otras muestras, ya que cada chip de matriz se expone a una sola muestra (a diferencia de un sistema de dos colores, en el que una sola muestra de baja calidad puede afectar drásticamente a la precisión general de los datos, incluso si la otra muestra es de alta calidad). Otra ventaja es que los datos se pueden comparar más fácilmente con matrices de diferentes experimentos, siempre que se hayan tenido en cuenta los efectos de lote.

En algunas situaciones, un microarreglo de un solo canal puede ser la única opción. Supongamos que${\displaystyle i}$Es necesario comparar las muestras: entonces, el número de experimentos requeridos utilizando los conjuntos de dos canales se vuelve rápidamente inviable, a menos que se utilice una muestra como referencia.

Este es un ejemplo de un experimento de microarrays de ADN que incluye detalles para un caso particular con el fin de explicar mejor los experimentos de microarrays de ADN, al tiempo que enumera las modificaciones para experimentos con ARN u otros experimentos alternativos.

1. Las dos muestras que se van a comparar (comparación por pares) se cultivan/adquieren. En este ejemplo, la muestra tratada ( caso ) y la muestra no tratada ( control ).
2. El ácido nucleico de interés se purifica: puede ser ARN para el análisis de expresión génica , ADN para hibridación comparativa o ADN/ARN unido a una proteína específica que se inmunoprecipita ( ChIP-on-chip ) para estudios epigenéticos o de regulación. En este ejemplo, el ARN total se aísla (tanto nuclear como citoplasmático ) mediante extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo (por ejemplo, Trizol ), que aísla la mayor parte del ARN (mientras que los métodos de columna tienen un límite de exclusión de 200 nucleótidos) y, si se realiza correctamente, ofrece una mayor pureza.
3. El ARN purificado se analiza para determinar su calidad (mediante electroforesis capilar ) y cantidad (por ejemplo, utilizando un espectrómetro NanoDrop o NanoPhotometer ). Si el material tiene una calidad aceptable y la cantidad es suficiente (p. ej., >1 μg , aunque la cantidad requerida varía según la plataforma de microarrays), el experimento puede continuar.
4. El producto marcado se genera mediante transcripción inversa , seguida de una amplificación por PCR opcional . El ARN se transcribe inversamente con cebadores poliT (que amplifican solo el ARNm ) o con cebadores aleatorios (que amplifican todo el ARN, principalmente ARNr ). Los microarrays de miRNA ligan un oligonucleótido al ARN pequeño purificado (aislado con un fraccionador), que luego se transcribe inversamente y se amplifica.
   • La etiqueta se añade durante la etapa de transcripción inversa o después de la amplificación, si esta se realiza. El sentido de la etiqueta depende del microchip; por ejemplo, si la etiqueta se añade con la mezcla de transcripción inversa, el ADNc es antisentido y la sonda del microchip es sentido, excepto en el caso de los controles negativos.
   • La etiqueta suele ser fluorescente ; solo una máquina utiliza radiomarcadores .
   • El marcaje puede ser directo (no se utiliza) o indirecto (requiere una etapa de acoplamiento). Para matrices de dos canales, la etapa de acoplamiento ocurre antes de la hibridación, utilizando aminoalil uridina trifosfato (aminoalil-UTP o aaUTP) y colorantes amino-reactivos NHS (como los colorantes de cianina ); para matrices de un solo canal, la etapa de acoplamiento ocurre después de la hibridación, utilizando biotina y estreptavidina marcada . Los nucleótidos modificados (generalmente en una proporción de 1 aaUTP: 4 TTP ( timidina trifosfato )) se agregan enzimáticamente en una proporción baja a los nucleótidos normales, lo que generalmente resulta en 1 cada 60 bases. El aaADN se purifica luego con una columna (utilizando una solución tampón de fosfato, ya que Tris contiene grupos amina). El grupo aminoalilo es un grupo amina en un largo enlazador unido a la nucleobase, que reacciona con un colorante reactivo.
     • Para controlar los artefactos de tinción en experimentos de dos canales, se puede realizar una réplica denominada inversión de colorante . En este caso, se utiliza una segunda lámina con las etiquetas intercambiadas (la muestra marcada con Cy3 en la primera lámina se marca con Cy5, y viceversa). En este ejemplo, la mezcla retrotranscrita contiene aminoalil- UTP.
5. Las muestras marcadas se mezclan luego con una solución de hibridación patentada que puede consistir en SDS , SSC , sulfato de dextrano , un agente bloqueador (como ADN Cot-1 , ADN de esperma de salmón, ADN de timo de ternero, poliA o poliT), solución de Denhardt o formamina .
6. La mezcla se desnaturaliza y se añade a los orificios del microchip. Los orificios se sellan y el microchip se hibrida, ya sea en un horno de hibridación, donde se mezcla mediante rotación, o en un mezclador, donde se mezcla mediante presión alterna en los orificios.
7. Tras una hibridación nocturna, se elimina mediante lavado (SDS y SSC) toda la unión inespecífica.
8. El microchip se seca y se escanea mediante una máquina que utiliza un láser para excitar el tinte y mide los niveles de emisión con un detector.
9. La imagen se divide en cuadrículas utilizando una plantilla y se cuantifica la intensidad de cada elemento (compuesto por varios píxeles).
10. Los datos brutos se normalizan; el método de normalización más sencillo consiste en restar la intensidad de fondo y escalarla de manera que las intensidades totales de las características de los dos canales sean iguales, o bien utilizar la intensidad de un gen de referencia para calcular el valor t para todas las intensidades. Métodos más sofisticados incluyen la relación z , la regresión loess y lowess, y el análisis robusto de múltiples chips (RMA) para chips Affymetrix (monocanal, chip de silicio, oligonucleótidos cortos sintetizados in situ ).

Debido a la complejidad biológica de la expresión génica, las consideraciones sobre el diseño experimental que se analizan en el artículo sobre el perfil de expresión son de vital importancia para poder extraer conclusiones estadísticamente y biológicamente válidas de los datos.

Al diseñar un experimento de microarrays, se deben considerar tres elementos principales. Primero, la replicación de las muestras biológicas es esencial para extraer conclusiones del experimento. Segundo, las réplicas técnicas (por ejemplo, dos muestras de ARN obtenidas de cada unidad experimental) pueden ayudar a cuantificar la precisión. Las réplicas biológicas incluyen extracciones de ARN independientes. Las réplicas técnicas pueden ser dos alícuotas de la misma extracción. Tercero, los puntos de cada clon de ADNc u oligonucleótido están presentes como réplicas (al menos duplicados) en la lámina del microarray, para proporcionar una medida de la precisión técnica en cada hibridación. Es fundamental que se discuta la información sobre la preparación y manipulación de las muestras, para ayudar a identificar las unidades independientes en el experimento y evitar estimaciones infladas de la significación estadística . ^{[ 20 ]}

El intercambio de datos de microarrays resulta difícil debido a la falta de estandarización en la fabricación de plataformas, los protocolos de ensayo y los métodos de análisis. Esto plantea un problema de interoperabilidad en bioinformática . Diversos proyectos de código abierto, impulsados ​​por la comunidad , buscan facilitar el intercambio y el análisis de datos generados con chips no propietarios.

Por ejemplo, la lista de verificación "Información mínima sobre un experimento de microarrays" ( MIAME ) ayuda a definir el nivel de detalle que debe existir y está siendo adoptada por muchas revistas como requisito para la presentación de artículos que incorporan resultados de microarrays. Pero MIAME no describe el formato de la información, por lo que, si bien muchos formatos pueden cumplir con los requisitos de MIAME, a partir de 2007Ningún formato permite verificar el cumplimiento semántico completo. El "Proyecto de Control de Calidad de Microarrays (MAQC)" está siendo llevado a cabo por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para desarrollar estándares y métricas de control de calidad que eventualmente permitirán el uso de datos de Microarrays en el descubrimiento de fármacos, la práctica clínica y la toma de decisiones regulatorias. ^{[ 21 ]} La Sociedad MGED ha desarrollado estándares para la representación de los resultados de experimentos de expresión génica y anotaciones relevantes.

Los conjuntos de datos de microarrays suelen ser muy grandes, y la precisión analítica se ve influenciada por diversas variables. Entre los desafíos estadísticos se incluyen tener en cuenta los efectos del ruido de fondo y la normalización adecuada de los datos. Los métodos de normalización pueden ser adecuados para plataformas específicas y, en el caso de plataformas comerciales, el análisis puede ser propietario. ^{[ 22 ]} Los algoritmos que afectan al análisis estadístico incluyen:

• Análisis de imágenes: cuadrícula, reconocimiento de puntos en la imagen escaneada (algoritmo de segmentación), eliminación o marcado de características de baja calidad y baja intensidad (denominado marcado ).
• Procesamiento de datos: sustracción del fondo (basada en el fondo global o local), determinación de las intensidades de los puntos y las razones de intensidad, visualización de los datos (por ejemplo, véase el gráfico MA ), y transformación logarítmica de las razones, normalización global o local de las razones de intensidad y segmentación en diferentes regiones de número de copias mediante algoritmos de detección de pasos . ^{[ 23 ]}
• Análisis de descubrimiento de clases: Este enfoque analítico, a veces llamado clasificación no supervisada o descubrimiento de conocimiento, intenta identificar si los microarrays (objetos, pacientes, ratones, etc.) o los genes se agrupan. Identificar grupos de objetos (microarrays o genes) existentes de forma natural que se agrupan puede permitir el descubrimiento de nuevos grupos que de otro modo no se conocían previamente. Durante el análisis de descubrimiento de conocimiento, se pueden emplear varias técnicas de clasificación no supervisada con datos de microarrays de ADN para identificar nuevos grupos (clases) de matrices. ^{[ 24 ]} Este tipo de enfoque no se basa en hipótesis, sino en métodos iterativos de reconocimiento de patrones o aprendizaje estadístico para encontrar un número "óptimo" de grupos en los datos. Ejemplos de métodos de análisis no supervisados ​​incluyen mapas autoorganizados, gas neuronal, análisis de clústeres k-means, ^{[ 25 ]} análisis de clústeres jerárquicos, agrupamiento basado en procesamiento de señales genómicas y análisis de clústeres basado en modelos. Para algunos de estos métodos, el usuario también tiene que definir una medida de distancia entre pares de objetos. Aunque el coeficiente de correlación de Pearson se emplea habitualmente, se han propuesto y evaluado otras medidas en la literatura. ^{[ 26 ]} Los datos de entrada utilizados en los análisis de descubrimiento de clases se basan comúnmente en listas de genes con alta capacidad informativa (bajo ruido) basadas en valores bajos del coeficiente de variación o valores altos de la entropía de Shannon, etc. La determinación del número más probable u óptimo de clústeres obtenidos de un análisis no supervisado se denomina validez del clúster. Algunas métricas comúnmente utilizadas para la validez del clúster son el índice de silueta, el índice de Davies-Bouldin, ^{[ 27 ]} el índice de Dunn o el índice de Hubert.${\displaystyle \Gamma }$estadística.
• Análisis de predicción de clases: Este enfoque, denominado clasificación supervisada, establece la base para desarrollar un modelo predictivo en el que se pueden introducir objetos de prueba desconocidos futuros para predecir la pertenencia a la clase más probable de los objetos de prueba. El análisis supervisado ^{[ 24 ]} para la predicción de clases implica el uso de técnicas como regresión lineal, k-vecinos más cercanos, cuantización vectorial de aprendizaje, análisis de árboles de decisión, bosques aleatorios, Naive Bayes, regresión logística, regresión de kernel, redes neuronales artificiales, máquinas de vectores de soporte, mezcla de expertos y gas neuronal supervisado. Además, se emplean varios métodos metaheurísticos, como algoritmos genéticos , auto-adaptación de matriz de covarianza, optimización por enjambre de partículas y optimización por colonia de hormigas . Los datos de entrada para la predicción de clases suelen basarse en listas filtradas de genes que son predictivos de la clase, determinados mediante pruebas de hipótesis clásicas (siguiente sección), índice de diversidad de Gini o ganancia de información (entropía).
• Análisis estadístico basado en hipótesis: La identificación de cambios estadísticamente significativos en la expresión génica se realiza comúnmente mediante la prueba t , ANOVA , el método bayesiano ^{[ 28 ]} , la prueba de Mann-Whitney , métodos adaptados a conjuntos de datos de microarrays que consideran comparaciones múltiples ^{[ 29 ]} o el análisis de conglomerados ^{[ 30 ]} . Estos métodos evalúan la potencia estadística en función de la variación presente en los datos y el número de réplicas experimentales, y pueden ayudar a minimizar los errores de tipo I y tipo II en los análisis ^{[ 31 ] .}
• Reducción de dimensionalidad: Los analistas suelen reducir el número de dimensiones (genes) antes del análisis de datos. ^{[ 24 ]} Esto puede implicar enfoques lineales como el análisis de componentes principales (PCA), o aprendizaje de variedades no lineales (aprendizaje de métricas de distancia) utilizando PCA de kernel, mapas de difusión, mapas propios laplacianos, incrustación lineal local, proyecciones que preservan localmente y mapeo de Sammon.
• Métodos basados ​​en redes: Métodos estadísticos que tienen en cuenta la estructura subyacente de las redes génicas, representando interacciones asociativas o causales, o dependencias entre productos génicos. ^{[ 32 ]} El análisis de redes de coexpresión génica ponderadas se utiliza ampliamente para identificar módulos de coexpresión y genes centrales intramodulares. Los módulos pueden corresponder a tipos celulares o vías metabólicas. Los nodos centrales intramodulares altamente conectados representan mejor sus respectivos módulos.

Los datos de microarrays pueden requerir un procesamiento adicional destinado a reducir la dimensionalidad de los datos para facilitar la comprensión y un análisis más específico. ^{[ 33 ]} Otros métodos permiten el análisis de datos que consisten en un número bajo de réplicas biológicas o técnicas ; por ejemplo, la prueba de error agrupado local (LPE) agrupa las desviaciones estándar de genes con niveles de expresión similares en un esfuerzo por compensar la replicación insuficiente. ^{[ 34 ]}

La relación entre una sonda y el ARNm que se espera que detecte no es trivial. ^{[ 35 ]} Algunos ARNm pueden hibridar de forma cruzada con sondas en el microarreglo que se supone que detectan otro ARNm. Además, los ARNm pueden experimentar un sesgo de amplificación que es específico de la secuencia o de la molécula. En tercer lugar, las sondas que están diseñadas para detectar el ARNm de un gen en particular pueden estar basándose en información EST genómica que está incorrectamente asociada con ese gen.

Se ha comprobado que los datos de microarrays son más útiles que otros conjuntos de datos similares. El gran volumen de datos, los formatos especializados (como MIAME ) y los esfuerzos de curación asociados a estos conjuntos de datos requieren bases de datos especializadas para su almacenamiento. Se han creado diversas soluciones de almacenamiento de datos de código abierto, como InterMine y BioMart , con el propósito específico de integrar conjuntos de datos biológicos diversos y facilitar su análisis.