Perfil de expresión genética

En el campo de la biología molecular , el perfil de expresión génica consiste en medir la actividad (la expresión ) de miles de genes simultáneamente para obtener una visión global de la función celular. Estos perfiles permiten, por ejemplo, distinguir entre células que se dividen activamente o mostrar cómo reaccionan las células ante un tratamiento específico. Muchos experimentos de este tipo miden simultáneamente un genoma completo , es decir, todos los genes presentes en una célula determinada.

Se pueden utilizar diversas tecnologías transcriptómicas para generar los datos necesarios para el análisis. Los microarrays de ADN ^{[ 1 ]} miden la actividad relativa de genes diana previamente identificados. Las técnicas basadas en secuencias, como RNA-Seq , proporcionan información sobre las secuencias de los genes, además de su nivel de expresión.

El análisis del perfil de expresión génica es un paso lógico tras la secuenciación del genoma : la secuencia nos indica las posibles funciones de la célula, mientras que el perfil de expresión nos revela su función en un momento dado. Los genes contienen las instrucciones para la síntesis de ARN mensajero ( ARNm ), pero en cualquier momento, cada célula sintetiza ARNm a partir de solo una fracción de los genes que posee. Si un gen se utiliza para producir ARNm, se considera activado; de lo contrario, está desactivado. Diversos factores determinan si un gen está activado o desactivado, como la hora del día, la división celular, su entorno y las señales químicas de otras células. Por ejemplo, las células de la piel , del hígado y de los nervios activan (expresan) genes ligeramente diferentes, lo que en gran medida las distingue. Por lo tanto, un perfil de expresión permite deducir el tipo, el estado y el entorno de una célula, entre otros datos.

Los experimentos de perfilado de expresión a menudo implican la medición de la cantidad relativa de ARNm expresado en dos o más condiciones experimentales. Esto se debe a que los niveles alterados de una secuencia específica de ARNm sugieren una necesidad modificada de la proteína codificada por dicho ARNm, lo que podría indicar una respuesta homeostática o una condición patológica. Por ejemplo, niveles más altos de ARNm que codifica la alcohol deshidrogenasa sugieren que las células o tejidos estudiados están respondiendo a niveles elevados de etanol en su entorno. De manera similar, si las células de cáncer de mama expresan niveles más altos de ARNm asociados con un receptor transmembrana particular que las células normales, es posible que este receptor desempeñe un papel en el cáncer de mama. Un fármaco que interfiera con este receptor podría prevenir o tratar el cáncer de mama. En el desarrollo de un fármaco, se pueden realizar experimentos de perfilado de expresión génica para ayudar a evaluar su toxicidad, por ejemplo, buscando cambios en los niveles de expresión de los genes del citocromo P450 , que pueden ser un biomarcador del metabolismo del fármaco . ^{[ 2 ]} El perfilado de expresión génica podría convertirse en una prueba diagnóstica importante. ^{[ 3 ] [ 4 ]}

El genoma humano contiene aproximadamente 20 000 genes que trabajan en conjunto para producir alrededor de 1 000 000 de proteínas distintas. Esto se debe al empalme alternativo y también a que las células realizan cambios importantes en las proteínas mediante modificación postraduccional después de su síntesis inicial, de modo que un gen determinado sirve de base para muchas versiones posibles de una proteína en particular. En cualquier caso, un solo experimento de espectrometría de masas puede identificar alrededor de 2000 proteínas ^{[ 5 ]} o el 0,2 % del total. Si bien el conocimiento de las proteínas precisas que produce una célula ( proteómica ) es más relevante que saber cuánto ARN mensajero se produce a partir de cada gen, el perfil de expresión génica proporciona la visión más global posible en un solo experimento. Sin embargo, la metodología de la proteómica está mejorando. En otras especies, como la levadura, es posible identificar más de 4000 proteínas en poco más de una hora. ^{[ 6 ]}

En ocasiones, un científico ya tiene una idea de lo que sucede, una hipótesis , y realiza un experimento de perfilado de expresión con la intención de refutarla. En otras palabras, el científico formula una predicción específica sobre los niveles de expresión que podría resultar falsa.

Más comúnmente, el perfil de expresión se lleva a cabo antes de que se sepa lo suficiente sobre cómo interactúan los genes con las condiciones experimentales como para que exista una hipótesis comprobable. Sin una hipótesis, no hay nada que refutar, pero el perfil de expresión puede ayudar a identificar una hipótesis candidata para experimentos futuros. La mayoría de los primeros experimentos de perfil de expresión, y muchos de los actuales, tienen esta forma ^{[ 7 ]} que se conoce como descubrimiento de clases. Un enfoque popular para el descubrimiento de clases implica agrupar genes o muestras similares utilizando uno de los muchos métodos de agrupamiento existentes, como el tradicional k-means o el agrupamiento jerárquico , o el más reciente MCL . ^{[ 8 ]} Además de seleccionar un algoritmo de agrupamiento, el usuario generalmente tiene que elegir una medida de proximidad apropiada (distancia o similitud) entre los objetos de datos. ^{[ 9 ]} La figura anterior representa el resultado de un clúster bidimensional, en el que las muestras similares (filas, arriba) y las sondas genéticas similares (columnas) se organizaron de manera que quedaran cerca unas de otras. La forma más simple de descubrimiento de clases sería enumerar todos los genes que cambiaron en más de una cierta cantidad entre dos condiciones experimentales.

La predicción de clases es más difícil que el descubrimiento de clases, pero permite responder preguntas de relevancia clínica directa, como por ejemplo: dado este perfil, ¿cuál es la probabilidad de que este paciente responda a este fármaco? Esto requiere numerosos ejemplos de perfiles que respondieron y no respondieron, así como técnicas de validación cruzada para diferenciarlos.

En general, los estudios de perfiles de expresión informan sobre aquellos genes que mostraron diferencias estadísticamente significativas bajo condiciones experimentales modificadas. Esto suele ser una pequeña fracción del genoma por varias razones. Primero, las diferentes células y tejidos expresan un subconjunto de genes como consecuencia directa de la diferenciación celular , por lo que muchos genes se desactivan. Segundo, muchos genes codifican proteínas necesarias para la supervivencia en cantidades muy específicas, por lo que muchos genes no cambian. Tercero, las células utilizan muchos otros mecanismos para regular las proteínas, además de alterar la cantidad de ARNm , por lo que estos genes pueden permanecer expresados ​​de forma constante incluso cuando las concentraciones de proteínas aumentan y disminuyen. Cuarto, las limitaciones financieras restringen los experimentos de perfiles de expresión a un pequeño número de observaciones del mismo gen en condiciones idénticas, lo que reduce la potencia estadística del experimento e imposibilita la identificación de cambios importantes pero sutiles. Finalmente, se requiere un gran esfuerzo para discutir la importancia biológica de cada gen regulado, por lo que los científicos a menudo limitan su discusión a un subconjunto. Las técnicas más recientes de análisis de microarrays automatizan ciertos aspectos de la atribución de importancia biológica a los resultados de los perfiles de expresión, pero este sigue siendo un problema muy difícil.

La relativa brevedad de las listas de genes publicadas a partir de experimentos de perfilado de expresión limita el grado de concordancia entre experimentos realizados en distintos laboratorios. Al incluir los resultados del perfilado de expresión en una base de datos de microarrays de acceso público , los investigadores pueden evaluar patrones de expresión que van más allá del alcance de los resultados publicados, identificando posibles similitudes con sus propios trabajos.

Tanto los microarrays de ADN como la PCR cuantitativa aprovechan la unión preferencial o el " apareamiento de bases " de secuencias de ácidos nucleicos complementarias , y ambos se utilizan en el análisis de la expresión génica, a menudo de forma secuencial. Si bien los microarrays de ADN de alto rendimiento carecen de la precisión cuantitativa de la qPCR, se tarda aproximadamente el mismo tiempo en medir la expresión génica de unas pocas docenas de genes mediante qPCR que en medir un genoma completo utilizando microarrays de ADN. Por lo tanto, suele ser conveniente realizar experimentos de análisis semicuantitativo de microarrays de ADN para identificar genes candidatos y, posteriormente, realizar qPCR en algunos de los genes candidatos más interesantes para validar los resultados de los microarrays. Otros experimentos, como un Western blot de algunos de los productos proteicos de genes con expresión diferencial, hacen que las conclusiones basadas en el perfil de expresión sean más convincentes, ya que los niveles de ARNm no se correlacionan necesariamente con la cantidad de proteína expresada.

El análisis de datos de microarrays se ha convertido en un área de intensa investigación. ^{[ 10 ]} Afirmar simplemente que un grupo de genes se regula al menos dos veces, una práctica común en el pasado, carece de fundamento estadístico sólido. Con cinco o menos réplicas en cada grupo, lo cual es típico en los microarrays, una sola observación atípica puede generar una diferencia aparente mayor al doble. Además, establecer arbitrariamente el umbral en el doble no es biológicamente correcto, ya que excluye muchos genes con una importancia biológica evidente.

En lugar de identificar genes con expresión diferencial mediante un umbral de cambio de expresión, se pueden utilizar diversas pruebas estadísticas o pruebas ómnibus como el ANOVA , que consideran tanto el cambio de expresión como la variabilidad para generar un valor p , una estimación de la frecuencia con la que se observarían los datos por azar. La aplicación de valores p a los microarrays se complica por la gran cantidad de comparaciones múltiples (genes) involucradas. Por ejemplo, un valor p de 0,05 se suele considerar significativo, ya que estima una probabilidad del 5 % de observar los datos por azar. Sin embargo, con 10 000 genes en un microarray, 500 genes se identificarían como significativos con un valor p < 0,05, incluso si no hubiera diferencias entre los grupos experimentales. Una solución obvia es considerar significativos solo aquellos genes que cumplan un criterio de valor p mucho más estricto; por ejemplo, se podría aplicar una corrección de Bonferroni a los valores p o utilizar un cálculo de la tasa de falsos descubrimientos para ajustar los valores p en proporción al número de pruebas paralelas involucradas. Desafortunadamente, estos enfoques pueden reducir a cero el número de genes significativos, incluso cuando los genes se expresan diferencialmente. Las estadísticas actuales, como los productos Rank, buscan un equilibrio entre el descubrimiento falso de genes debido a la variación aleatoria y la no detección de genes con expresión diferencial. Entre los métodos más citados se encuentra el Análisis de Significancia de Microarrays (SAM) ^{[ 11 ]} , y existe una amplia variedad de métodos disponibles en Bioconductor y diversos paquetes de análisis de empresas de bioinformática .

Seleccionar una prueba diferente generalmente identifica una lista distinta de genes significativos ^{[ 12 ],} ya que cada prueba opera bajo un conjunto específico de supuestos y pone un énfasis diferente en ciertas características de los datos. Muchas pruebas parten del supuesto de una distribución normal en los datos, porque parece un punto de partida sensato y a menudo produce resultados que parecen más significativos. Algunas pruebas consideran la distribución conjunta de todas las observaciones genéticas para estimar la variabilidad general en las mediciones ^{[ 13 ]} , mientras que otras analizan cada gen de forma aislada. Muchas técnicas modernas de análisis de microarrays implican el remuestreo (estadística) , el aprendizaje automático o los métodos de Monte Carlo ^{[ 14 ]} .

A medida que aumenta el número de mediciones replicadas en un experimento de microarrays, los distintos enfoques estadísticos arrojan resultados cada vez más similares, pero la falta de concordancia entre los diferentes métodos estadísticos hace que los resultados de los microarrays parezcan menos fiables. El proyecto MAQC ^{[ 15 ]} formula recomendaciones para guiar a los investigadores en la selección de métodos más estandarizados (por ejemplo, utilizando el valor p y el cambio de expresión conjuntamente para seleccionar los genes con expresión diferencial) de modo que los experimentos realizados en diferentes laboratorios coincidan mejor.

A diferencia del análisis de genes individuales expresados ​​diferencialmente, otro tipo de análisis se centra en la expresión diferencial o perturbación de conjuntos de genes predefinidos y se denomina análisis de conjuntos de genes. ^{[ 16 ] [ 17 ]} El análisis de conjuntos de genes ha demostrado varias ventajas importantes sobre el análisis de expresión diferencial de genes individuales. ^{[ 16 ] [ 17 ]} Los conjuntos de genes son grupos de genes que están relacionados funcionalmente según el conocimiento actual. Por lo tanto, el análisis de conjuntos de genes se considera un enfoque de análisis basado en el conocimiento. ^{[ 16 ]} Los conjuntos de genes comúnmente utilizados incluyen aquellos derivados de las vías KEGG , términos de Gene Ontology , grupos de genes que comparten algunas otras anotaciones funcionales, como reguladores transcripcionales comunes, etc. Los métodos representativos de análisis de conjuntos de genes incluyen el Análisis de Enriquecimiento de Conjuntos de Genes (GSEA), ^{[ 16 ]} que estima la significancia de los conjuntos de genes basándose en la permutación de etiquetas de muestras, y el Enriquecimiento de Conjuntos de Genes de Aplicación General (GAGE), ^{[ 17 ]} que prueba la significancia de los conjuntos de genes basándose en la permutación de etiquetas de genes o una distribución paramétrica.

Si bien las estadísticas pueden identificar qué productos génicos cambian bajo condiciones experimentales, la interpretación biológica del perfil de expresión se basa en conocer qué proteína produce cada producto génico y qué función desempeña esta proteína. La anotación génica proporciona información funcional y de otro tipo, por ejemplo, la ubicación de cada gen dentro de un cromosoma específico. Algunas anotaciones funcionales son más fiables que otras; algunas están ausentes. Las bases de datos de anotación génica cambian con regularidad, y diversas bases de datos se refieren a la misma proteína con nombres diferentes, lo que refleja una comprensión cambiante de la función proteica. El uso de una nomenclatura génica estandarizada ayuda a abordar el aspecto de la nomenclatura del problema, pero la correspondencia exacta de los transcritos con los genes ^{[ 18 ] [ 19 ]} sigue siendo una consideración importante.

Una vez identificado un conjunto de genes regulados, el siguiente paso en el análisis de la expresión génica consiste en buscar patrones dentro de dicho conjunto. ¿Las proteínas producidas por estos genes desempeñan funciones similares? ¿Son químicamente similares? ¿Se localizan en partes similares de la célula? El análisis de ontología génica proporciona una forma estandarizada de definir estas relaciones. Las ontologías génicas parten de categorías muy amplias, como el "proceso metabólico", y las subdividen en categorías más pequeñas, como el "proceso metabólico de carbohidratos", y finalmente en categorías bastante restrictivas como la " fosforilación de inositol y sus derivados".

Los genes poseen otros atributos además de su función biológica, propiedades químicas y localización celular. Es posible crear conjuntos de genes según su proximidad a otros genes, su asociación con una enfermedad y su relación con fármacos o toxinas. La Base de Datos de Firmas Moleculares ^{[ 20 ]} y la Base de Datos de Toxicogenómica Comparativa ^{[ 21 ]} son ​​ejemplos de recursos para categorizar genes de diversas maneras.

Los genes regulados se clasifican según su naturaleza y función, y pueden surgir relaciones importantes entre ellos. ^{[ 23 ]} Por ejemplo, podríamos observar evidencia de que un gen determinado crea una proteína para producir una enzima que activa otra proteína para activar un segundo gen de nuestra lista. Este segundo gen podría ser un factor de transcripción que regula otro gen de nuestra lista. Al observar estos vínculos, podríamos empezar a sospechar que representan mucho más que asociaciones casuales en los resultados, y que todos están en nuestra lista debido a un proceso biológico subyacente. Por otro lado, podría ser que si se seleccionaran genes al azar, se encontraran muchos que parecen tener algo en común. En este sentido, necesitamos procedimientos estadísticos rigurosos para comprobar si los temas biológicos emergentes son significativos o no. Ahí es donde entra en juego el análisis de conjuntos de genes ^{[ 16 ] [ 17 ] .}

El análisis de la expresión génica proporciona información novedosa sobre la función de los genes en diversas condiciones. En general, la tecnología de microarrays genera perfiles de expresión fiables. ^{[ 28 ]} A partir de esta información, se pueden formular nuevas hipótesis sobre biología o poner a prueba las existentes. Sin embargo, el tamaño y la complejidad de estos experimentos suelen dar lugar a una amplia variedad de posibles interpretaciones. En muchos casos, analizar los resultados del análisis de la expresión génica requiere mucho más esfuerzo que realizar los experimentos iniciales.

La mayoría de los investigadores utilizan múltiples métodos estadísticos y análisis exploratorios de datos antes de publicar los resultados de sus perfiles de expresión, coordinando sus esfuerzos con un bioinformático u otro experto en microarrays de ADN , secuenciación de ARN y secuenciación de células individuales . Un buen diseño experimental, una replicación biológica adecuada y experimentos de seguimiento desempeñan un papel fundamental en el éxito de los experimentos de perfiles de expresión.

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