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Articulo de referencia

Secuenciación de ARN

Resumen de RNA-Seq. Dentro del organismo, los genes se transcriben y (en un organismo eucariota ) se empalman para producir transcritos de ARNm maduros (rojo). El ARNm se extrae...

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Resumen de RNA-Seq. Dentro del organismo, los genes se transcriben y (en un organismo eucariota ) se empalman para producir transcritos de ARNm maduros (rojo). El ARNm se extrae del organismo, se fragmenta y se copia en ADNc bicatenario estable (azul). El ADNc bicatenario se secuencia mediante métodos de secuenciación de alto rendimiento y lectura corta. Estas secuencias se pueden alinear con una secuencia de genoma de referencia para reconstruir qué regiones del genoma se estaban transcribiendo. Estos datos se pueden utilizar para anotar dónde se expresan los genes, sus niveles de expresión relativos y cualquier variante de empalme alternativa. [ 1 ]

RNA-Seq (abreviatura de secuenciación de ARN ) es una técnica de secuenciación de nueva generación (NGS) que se utiliza para cuantificar e identificar moléculas de ARN en una muestra biológica, proporcionando una instantánea del transcriptoma en un momento específico. [ 2 ] Permite el análisis de todo el transcriptoma mediante la secuenciación de ADNc derivado del ARN. [ 3 ] Los flujos de trabajo modernos suelen incorporar herramientas de pseudoalineación (como Kallisto y Salmon) y plataformas de procesamiento en la nube, lo que mejora la velocidad, la escalabilidad y la reproducibilidad.

RNA-Seq facilita la capacidad de observar transcripciones de empalme alternativo de genes , modificaciones postranscripcionales , fusión de genes , mutaciones/ SNP y cambios en la expresión génica a lo largo del tiempo, o diferencias en la expresión génica en diferentes grupos o tratamientos. [ 4 ] Además de las transcripciones de ARNm, RNA-Seq puede observar diferentes poblaciones de ARN para incluir ARN total, ARN pequeño, como miRNA , tRNA y perfil ribosomal . [ 5 ] RNA-Seq también se puede utilizar para determinar límites de exones / intrones y verificar o enmendar límites de genes 5' y 3' previamente anotados . Los avances recientes en RNA-Seq incluyen secuenciación de células individuales , secuenciación de ARN masivo , [ 6 ] secuenciación de ARNm 3' , secuenciación in situ de tejido fijado y secuenciación de moléculas de ARN nativas [ 7 ] con secuenciación en tiempo real de molécula única. [ 8 ] Otros ejemplos de aplicaciones emergentes de RNA-Seq debido al avance de los algoritmos bioinformáticos son la alteración del número de copias, la contaminación microbiana, los elementos transponibles, el tipo de célula (deconvolución) y la presencia de neoantígenos. [ 9 ]

Historia

Las coincidencias de manuscritos en PubMed resaltan la creciente popularidad de la secuenciación de ARN (RNA-Seq). Las coincidencias son para RNA-Seq (azul, términos de búsqueda: "RNA Seq" O "RNA-Seq" O "RNA sequencing" O "RNASeq") [ 10 ] y RNA=Seq en medicina (dorado, términos de búsqueda: ("RNA Seq" O "RNA-Seq" O "RNA sequencing" O "RNASeq") Y "Medicine"). [ 11 ] El número de manuscritos en PubMed que presentan RNA-Seq sigue aumentando.

Antes de la secuenciación de ARN (RNA-Seq), los estudios de expresión génica se realizaban con microarrays basados ​​en hibridación . Los problemas con los microarrays incluyen artefactos de hibridación cruzada, cuantificación deficiente de genes con baja y alta expresión, y la necesidad de conocer la secuencia a priori . [ 12 ] Debido a estos problemas técnicos, la transcriptómica pasó a utilizar métodos basados ​​en secuenciación. Estos progresaron desde la secuenciación de Sanger de bibliotecas de etiquetas de secuencias expresadas , pasando por métodos basados ​​en etiquetas químicas (por ejemplo, análisis serial de la expresión génica ), hasta llegar a la tecnología actual, la secuenciación de próxima generación de ADN complementario (ADNc), en particular la RNA-Seq a mediados de la década de 2000. [ 13 ]

Los primeros manuscritos que utilizaron RNA-Seq incluso sin usar el término incluyen los de líneas celulares de cáncer de próstata [ 14 ] (fechado en 2006), Medicago truncatula [ 15 ] (2006), maíz [ 16 ] (2007), mientras que el término "RNA-Seq" en sí se mencionó por primera vez en 2008. [ 7 ] [ 17 ] [ 18 ] El número de manuscritos que hacen referencia a RNA-Seq en el título o resumen (Figura, línea azul) está aumentando continuamente con 6754 manuscritos publicados en 2018. La intersección de RNA-Seq y medicina (Figura, línea dorada) tiene una celeridad similar. [ 19 ]

Métodos

Preparación de la biblioteca

Flujo de trabajo experimental típico de RNA-Seq. El ARN se aísla de múltiples muestras, se convierte en bibliotecas de ADNc, se secuencia en un formato legible por ordenador, se alinea con una referencia y se cuantifica para análisis posteriores como la expresión diferencial y el empalme alternativo. Descripción general de un flujo de trabajo experimental típico de RNA-Seq. [ 20 ]

A continuación se describen los pasos generales para preparar una biblioteca de ADN complementario (ADNc) para secuenciación, pero estos suelen variar entre plataformas. [ 20 ] [ 3 ] [ 21 ]

  1. Aislamiento de ARN: El ARN se aísla del tejido y se mezcla con desoxirribonucleasa (DNasa). La DNasa reduce la cantidad de ADN genómico. El grado de degradación del ARN se verifica mediante electroforesis en gel y capilar , y se utiliza para asignar un índice de integridad del ARN a la muestra. Esta calidad del ARN y la cantidad total de ARN inicial se tienen en cuenta durante los pasos posteriores de preparación de la biblioteca, secuenciación y análisis.
  2. Selección/eliminación de ARN: Para analizar señales de interés, el ARN aislado puede mantenerse tal cual, enriquecerse con ARN con colas poliadeniladas (poli(A)) en 3' para incluir solo ARNm eucariota , eliminar el ARN ribosómico (ARNr) y/o filtrarse para ARN que se une a secuencias específicas ( tabla de métodos de selección y eliminación de ARN , a continuación). Las moléculas de ARN que tienen colas poli(A) en 3' en eucariotas están compuestas principalmente por secuencias codificantes maduras y procesadas. La selección de poli(A) se realiza mezclando ARN con oligómeros de poli(T) unidos covalentemente a un sustrato, típicamente perlas magnéticas. [ 22 ] [ 17 ] La selección de poli(A) tiene limitaciones importantes en la detección de biotipos de ARN. Muchos biotipos de ARN no están poliadenilados, incluyendo muchos ARN no codificantes y transcritos de proteínas del núcleo de histonas , o están regulados por la longitud de su cola de poli(A) (p. ej., citocinas) y por lo tanto podrían no ser detectados después de la selección de poli(A). [ 23 ] Además, la selección de poli(A) puede mostrar un sesgo 3' aumentado, especialmente con ARN de menor calidad. [ 24 ] [ 25 ] Estas limitaciones pueden evitarse con el agotamiento ribosomal, eliminando el ARNr que normalmente representa más del 90% del ARN en una célula. Tanto el enriquecimiento de poli(A) como los pasos de agotamiento ribosomal son laboriosos y podrían introducir sesgos, por lo que se han desarrollado enfoques más simples para omitir estos pasos. [ 26 ] Los objetivos de ARN pequeños, como el miRNA , pueden aislarse aún más a través de la selección de tamaño con geles de exclusión, perlas magnéticas o kits comerciales.
  3. Síntesis de ADNc: El ARN se transcribe inversamente a ADNc porque el ADN es más estable y para permitir la amplificación (que utiliza ADN polimerasas ) y aprovechar la tecnología de secuenciación de ADN más avanzada. La amplificación posterior a la transcripción inversa produce una pérdida de la direccionalidad , que puede evitarse con marcaje químico o secuenciación de molécula única. Se realiza la fragmentación y la selección de tamaño para purificar secuencias que tengan la longitud adecuada para la máquina de secuenciación. El ARN, el ADNc o ambos se fragmentan con enzimas, sonicación , iones divalentes o nebulizadores. La fragmentación del ARN reduce el sesgo 5' de la transcripción inversa con cebadores aleatorios y la influencia de los sitios de unión de los cebadores , [ 17 ] con la desventaja de que los extremos 5' y 3' se convierten en ADN de forma menos eficiente. La fragmentación va seguida de la selección de tamaño, donde se eliminan las secuencias pequeñas o se selecciona un rango estrecho de longitudes de secuencia. Debido a que se pierden los ARN pequeños como los miRNA , estos se analizan de forma independiente. El ADNc de cada experimento puede indexarse ​​con un código de barras hexamérico u octamérico, de modo que estos experimentos puedan agruparse en un solo carril para la secuenciación multiplexada.

Secuenciación de ADN complementario (cDNA-Seq)

La biblioteca de ADNc derivada de biotipos de ARN se secuencia posteriormente en un formato legible por ordenador. Existen numerosas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para la secuenciación de ADNc, incluidas las plataformas desarrolladas por Illumina , Thermo Fisher , BGI/MGI , PacBio y Oxford Nanopore Technologies . [ 27 ] Para la secuenciación de lectura corta de Illumina, una tecnología común para la secuenciación de ADNc, se ligan adaptadores al ADNc, el ADN se une a una celda de flujo, se generan clústeres mediante ciclos de amplificación de puente y desnaturalización, y la secuenciación por síntesis se realiza en ciclos de síntesis de cadena complementaria y excitación láser de bases con terminadores reversibles. La elección de la plataforma de secuenciación y sus parámetros se guían por el diseño experimental y el coste. Las consideraciones comunes del diseño experimental incluyen la decisión sobre la longitud de secuenciación, la profundidad de secuenciación, el uso de secuenciación de extremo único frente a secuenciación de extremos apareados, el número de réplicas, la multiplexación, la aleatorización y los spike-ins . [ 28 ]

En primer lugar, se extrae el ARNm celular y se fragmenta en secuencias de ARNm más pequeñas, que luego se someten a transcripción inversa. Los ADNc resultantes se secuencian en una plataforma de secuenciación de nueva generación (NGS). Los resultados de esta secuenciación permiten generar mapas genómicos de secuenciación transcriptómica.
Técnica experimental de secuenciación del transcriptoma (RNA-seq).

Secuenciación de ARN pequeños/ARN no codificantes

Al secuenciar ARN distinto del ARNm, se modifica la preparación de la biblioteca. El ARN celular se selecciona según el rango de tamaño deseado. Para ARN pequeños, como los microARN (miRNA) , el ARN se aísla mediante selección por tamaño. Esto puede realizarse con un gel de exclusión por tamaño, perlas magnéticas de selección por tamaño o un kit comercial. Una vez aislado, se añaden adaptadores a los extremos 3' y 5' y se purifica. El último paso es la generación de ADNc mediante transcripción inversa.

Secuenciación directa de ARN

Debido a que la conversión de ARN en ADNc , la ligación, la amplificación y otras manipulaciones de muestras han demostrado introducir sesgos y artefactos que pueden interferir con la caracterización y cuantificación adecuadas de los transcritos, [ 29 ] empresas como Helicos (en quiebra), Oxford Nanopore Technologies , [ 30 ] y otras han explorado la secuenciación directa de ARN de molécula única . Esta tecnología secuencia moléculas de ARN directamente de forma masivamente paralela.

Secuenciación de ARN en tiempo real de molécula única

La secuenciación de ARN directa de molécula única masivamente paralela se ha explorado como una alternativa a la secuenciación de ARN tradicional, en la que la conversión de ARN a ADNc , la ligación, la amplificación y otros pasos de manipulación de la muestra pueden introducir sesgos y artefactos. [ 31 ] Las plataformas tecnológicas que realizan secuenciación de ARN en tiempo real de molécula única incluyen la secuenciación Nanopore de Oxford Nanopore Technologies (ONT) . [ 30 ] La secuenciación de ARN en su forma nativa conserva modificaciones como la metilación, lo que permite investigarlas de forma directa y simultánea. [ 30 ] Otro beneficio de la secuenciación de ARN directa de molécula única es que los transcritos se pueden cubrir en su longitud completa, lo que permite una detección y cuantificación de isoformas con mayor confianza en comparación con la secuenciación de lectura corta. Tradicionalmente, los métodos de secuenciación de ARN de molécula única tienen tasas de error más altas en comparación con la secuenciación de lectura corta, pero los métodos más nuevos como la secuenciación de ARN directa de ONT tienen una tasa de error reducida. Los usos recientes de la secuenciación directa de ARN ONT para la expresión diferencial en poblaciones de células humanas han demostrado que esta tecnología puede superar muchas limitaciones de la secuenciación de ADNc corto y largo. [ 32 ]

Secuenciación de ARN de célula única (scRNA-Seq)

Los métodos estándar, como los microarrays y el análisis estándar de secuenciación de ARN (RNA-Seq) en masa, analizan la expresión de ARN de grandes poblaciones celulares. En poblaciones celulares mixtas, estas mediciones pueden ocultar diferencias cruciales entre las células individuales dentro de estas poblaciones. [ 33 ] [ 34 ]

La secuenciación de ARN de célula única (scRNA-Seq) proporciona los perfiles de expresión de células individuales. Si bien no es posible obtener información completa sobre cada ARN expresado por cada célula, debido a la pequeña cantidad de material disponible, se pueden identificar patrones de expresión génica mediante análisis de agrupamiento de genes. Esto puede revelar la existencia de tipos celulares raros dentro de una población celular que quizás nunca se habían observado antes. Por ejemplo, en 2018, dos grupos que realizaron scRNA-Seq en epitelios de las vías respiratorias pulmonares identificaron células especializadas raras en el pulmón llamadas ionocitos pulmonares que expresan el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística . [ 35 ] [ 36 ]

Consideraciones experimentales

Se tienen en cuenta diversos parámetros al diseñar y realizar experimentos de secuenciación de ARN (RNA-Seq):

  • Especificidad tisular: La expresión génica varía dentro y entre los tejidos, y la secuenciación de ARN (RNA-Seq) mide esta mezcla de tipos celulares. Esto puede dificultar el aislamiento del mecanismo biológico de interés. La secuenciación de células individuales permite estudiar cada célula por separado, lo que mitiga este problema.
  • Dependencia temporal: La expresión génica cambia con el tiempo, y la secuenciación de ARN (RNA-Seq) solo captura una instantánea. Se pueden utilizar métodos de secuenciación de ARN con resolución temporal para observar los cambios en el transcriptoma.
  • Cobertura (también conocida como profundidad): El ARN contiene las mismas mutaciones que el ADN, y su detección requiere una mayor cobertura. Con una cobertura suficientemente alta, la secuenciación de ARN (RNA-Seq) puede utilizarse para estimar la expresión de cada alelo . Esto puede aportar información sobre fenómenos como la impronta genómica o los efectos cis-reguladores . La profundidad de secuenciación necesaria para aplicaciones específicas puede extrapolarse a partir de un experimento piloto. [ 37 ]
  • Artefactos en la generación de datos (también conocidos como varianza técnica): Los reactivos (por ejemplo, el kit de preparación de la biblioteca), el personal involucrado y el tipo de secuenciador (por ejemplo, Illumina , Pacific Biosciences ) pueden generar artefactos técnicos que podrían interpretarse erróneamente como resultados significativos. Como en cualquier experimento científico, es prudente realizar la secuenciación de ARN en un entorno bien controlado. Si esto no es posible o el estudio es un metaanálisis , otra solución es detectar artefactos técnicos infiriendo variables latentes (normalmente análisis de componentes principales o análisis factorial ) y posteriormente corregir estas variables. [ 38 ]
  • Gestión de datos: Un único experimento de RNA-Seq en humanos suele ocupar entre 1 y 5 Gb (comprimidos), o incluso más si se incluyen archivos intermedios. [ 39 ] Este gran volumen de datos puede plantear problemas de almacenamiento. Una solución consiste en comprimir los datos utilizando esquemas computacionales multipropósito (p. ej., gzip ) o esquemas específicos para genómica. Estos últimos pueden basarse en secuencias de referencia o ser de novo. Otra solución es realizar experimentos de microarrays, que pueden ser suficientes para trabajos basados ​​en hipótesis o estudios de replicación (a diferencia de la investigación exploratoria).

Análisis

Ensamblaje del transcriptoma

Un flujo de trabajo estándar para el análisis de RNA-Seq. Las lecturas secuenciadas se alinean con un genoma o transcriptoma de referencia y, posteriormente, se procesan para diversos análisis de control de calidad, descubrimiento y basados ​​en hipótesis.

Se utilizan dos métodos para asignar lecturas de secuencias sin procesar a características genómicas (es decir, ensamblar el transcriptoma):

  • De novo: Este enfoque no requiere un genoma de referencia para reconstruir el transcriptoma y se usa típicamente si el genoma es desconocido, incompleto o sustancialmente alterado en comparación con la referencia. [ 40 ] Los desafíos cuando se usan lecturas cortas para el ensamblaje de novo incluyen 1) determinar qué lecturas deben unirse en secuencias contiguas ( contigs ), 2) robustez a errores de secuenciación y otros artefactos, y 3) eficiencia computacional. El algoritmo principal utilizado para el ensamblaje de novo pasó de los gráficos de solapamiento, que identifican todos los solapamientos por pares entre lecturas, a los gráficos de De Bruijn , que dividen las lecturas en secuencias de longitud k y colapsan todos los k-meros en una tabla hash . [ 41 ] Los gráficos de solapamiento se usaron con la secuenciación de Sanger, pero no escalan bien a los millones de lecturas generadas con RNA-Seq. Ejemplos de ensambladores que utilizan grafos de De Bruijn son Trinity, [ 40 ] Oases [ 42 ] (derivado del ensamblador de genomas Velvet [ 43 ] ), Bridger, [ 44 ] y rnaSPAdes. [ 45 ] La secuenciación de extremos emparejados y de lectura larga de la misma muestra puede mitigar los déficits de la secuenciación de lectura corta al servir como plantilla o esqueleto. Las métricas para evaluar la calidad de un ensamblaje de novo incluyen la longitud mediana de los contigs, el número de contigs y N50 . [ 46 ]
Alineación de secuencias de ARN con lecturas cortas separadas por intrones. Alineación de lecturas cortas con una secuencia de ARNm y el genoma de referencia. El software de alineación debe tener en cuenta las lecturas cortas que se superponen con las uniones exón-exón (en rojo) y, por lo tanto, omiten las secciones intrónicas del pre-ARNm y del genoma de referencia.
  • Guiado por el genoma: Este enfoque se basa en los mismos métodos utilizados para la alineación de ADN, con la complejidad adicional de alinear lecturas que cubren porciones no continuas del genoma de referencia. [ 47 ] Estas lecturas no continuas son el resultado de la secuenciación de transcripciones empalmadas (ver figura). Por lo general, los algoritmos de alineación tienen dos pasos: 1) alinear porciones cortas de la lectura (es decir, sembrar el genoma) y 2) usar programación dinámica para encontrar una alineación óptima, a veces en combinación con anotaciones conocidas. Las herramientas de software que utilizan la alineación guiada por el genoma incluyen Bowtie , [ 48 ] TopHat (que se basa en los resultados de BowTie para alinear uniones de empalme), [ 49 ] [ 50 ] Subread, [ 51 ] STAR, [ 47 ] HISAT2, [ 52 ] y GMAP. [ 53 ] La salida de las herramientas de alineación (mapeo) guiadas por el genoma puede ser utilizada posteriormente por herramientas como Cufflinks [ 50 ] o StringTie [ 54 ] para reconstruir secuencias de transcripción contiguas ( es decir , un archivo FASTA). La calidad de un ensamblaje guiado por el genoma puede medirse con 1) métricas de ensamblaje de novo (p. ej., N50) y 2) comparaciones con secuencias conocidas de transcripción, unión de empalme, genoma y proteínas utilizando precisión, exhaustividad o su combinación (p. ej., puntuación F1). [ 46 ] Además, se podría realizar una evaluación in silico utilizando lecturas simuladas. [ 55 ] [ 56 ]

Nota sobre la calidad del ensamblaje: El consenso actual es que 1) la calidad del ensamblaje puede variar según la métrica utilizada, 2) las herramientas de ensamblaje que obtuvieron buenos resultados en una especie no necesariamente funcionan bien en la otra, y 3) la combinación de diferentes enfoques podría ser la más fiable. [ 57 ] [ 58 ] [ 59 ]

cuantificación de la expresión génica

La expresión se cuantifica para estudiar los cambios celulares en respuesta a estímulos externos, las diferencias entre estados de salud y enfermedad , y otras cuestiones de investigación. Los niveles de transcripción se utilizan a menudo como un indicador de la abundancia de proteínas, pero estos no suelen ser equivalentes debido a eventos postranscripcionales como la interferencia de ARN y la degradación mediada por codones de terminación prematura . [ 60 ]

La expresión se cuantifica contando el número de lecturas que se mapearon a cada locus en el paso de ensamblaje del transcriptoma . La expresión se puede cuantificar para exones o genes utilizando contigs o anotaciones de transcripciones de referencia. [ 20 ] Estos recuentos de lecturas de RNA-Seq observados se han validado de forma robusta frente a tecnologías más antiguas, incluidos los microarrays de expresión y la qPCR . [ 37 ] [ 61 ] Las herramientas que cuantifican los recuentos son HTSeq, [ 62 ] FeatureCounts, [ 63 ] Rcount, [ 64 ] maxcounts, [ 65 ] FIXSEQ, [ 66 ] y Cuffquant. Estas herramientas determinan los recuentos de lecturas a partir de datos de RNA-Seq alineados, pero también se pueden obtener recuentos sin alineación con Sailfish [ 67 ] y Kallisto. [ 68 ] Los recuentos de lecturas se convierten luego en métricas apropiadas para pruebas de hipótesis, regresiones y otros análisis. Los parámetros para esta conversión son:

  • Profundidad/cobertura de secuenciación : Aunque la profundidad se especifica previamente al realizar múltiples experimentos de RNA-Seq, variará ampliamente entre experimentos. [ 69 ] Por lo tanto, el número total de lecturas generadas en un solo experimento se normaliza típicamente convirtiendo los recuentos a fragmentos, lecturas o recuentos por millón de lecturas mapeadas (FPM, RPM o CPM). La diferencia entre RPM y FPM se derivó históricamente durante la evolución de la secuenciación de extremos simples de fragmentos a la secuenciación de extremos emparejados. En la secuenciación de extremos simples, hay solo una lectura por fragmento ( es decir , RPM = FPM). En la secuenciación de extremos emparejados, hay dos lecturas por fragmento ( es decir , RPM = 2 x FPM). La profundidad de secuenciación a veces se denomina tamaño de la biblioteca , el número de moléculas de ADNc intermedias en el experimento.
  • Longitud del gen: Los genes más largos tendrán más fragmentos/lecturas/recuentos que los genes más cortos si la expresión del transcrito es la misma. Esto se ajusta dividiendo el FPM por la longitud de una característica (que puede ser un gen, un transcrito o un exón), lo que da como resultado la métrica fragmentos por kilobase de característica por millón de lecturas mapeadas (FPKM). [ 70 ] Al observar grupos de características en diferentes muestras, el FPKM se convierte a transcripciones por millón (TPM) dividiendo cada FPKM por la suma de los FPKM dentro de una muestra. [ 71 ] [ 72 ] [ 73 ]
  • Salida total de ARN de la muestra: Debido a que se extrae la misma cantidad de ARN de cada muestra, las muestras con mayor cantidad de ARN total tendrán menos ARN por gen. Estos genes parecen tener una expresión disminuida, lo que resulta en falsos positivos en los análisis posteriores. [ 69 ] Las estrategias de normalización, incluidas quantile, DESeq2, TMM y Median Ratio, intentan compensar esta diferencia comparando un conjunto de genes no expresados ​​diferencialmente entre muestras y escalando en consecuencia. [ 74 ]
  • Varianza para la expresión de cada gen: se modela para tener en cuenta el error de muestreo (importante para genes con recuentos de lectura bajos), aumentar la potencia y disminuir los falsos positivos. La varianza se puede estimar como unadistribución normal , de Poisson o binomial negativa [ 75 ] [ 76 ] [ 77 ] y frecuentemente se descompone en varianza técnica y biológica.

Componentes específicos para la cuantificación absoluta y la detección de efectos en todo el genoma.

Las muestras de ARN de control (spike-ins) son muestras de ARN en concentraciones conocidas que pueden utilizarse como patrones de referencia en el diseño experimental y durante los análisis posteriores para la cuantificación absoluta y la detección de efectos en todo el genoma.

  • Cuantificación absoluta: La cuantificación absoluta de la expresión génica no es posible con la mayoría de los experimentos de RNA-Seq, que cuantifican la expresión en relación con todos los transcritos. Es posible mediante la realización de RNA-Seq con spike-ins , muestras de ARN a concentraciones conocidas. Después de la secuenciación, los recuentos de lecturas de las secuencias spike-in se utilizan para determinar la relación entre los recuentos de lecturas de cada gen y las cantidades absolutas de fragmentos biológicos. [ 17 ] [ 78 ] En un ejemplo, esta técnica se utilizó en embriones de Xenopus tropicalis para determinar la cinética de transcripción. [ 79 ]
  • Detección de efectos en todo el genoma: Los cambios en los reguladores globales, incluidos los remodeladores de cromatina , los factores de transcripción (por ejemplo, MYC ), los complejos de acetiltransferasa y el posicionamiento de los nucleosomas, no son congruentes con los supuestos de normalización y los controles de inserción pueden ofrecer una interpretación precisa. [ 80 ] [ 81 ]

Aplicaciones

Expresión diferencial

El uso más simple, pero a menudo más potente, de la secuenciación de ARN (RNA-Seq) es encontrar diferencias en la expresión génica entre dos o más condiciones ( por ejemplo , tratadas frente a no tratadas); este proceso se denomina expresión diferencial. Los resultados se conocen frecuentemente como genes diferencialmente expresados ​​(GDE) y estos genes pueden estar regulados al alza o a la baja ( es decir , con niveles más altos o más bajos en la condición de interés). Existen muchas herramientas para realizar análisis de expresión diferencial . La mayoría se ejecutan en R , Python o la línea de comandos de Unix . Algunas herramientas de uso común son DESeq, [ 76 ] edgeR, [ 77 ] y voom+limma, [ 75 ] [ 82 ] todas disponibles a través de R/ Bioconductor . [ 83 ] [ 84 ] Estas son las consideraciones comunes al realizar análisis de expresión diferencial:

  • Entradas: Las entradas de expresión diferencial incluyen (1) una matriz de expresión de RNA-Seq (M genes x N muestras) y (2) una matriz de diseño que contiene las condiciones experimentales para N muestras. La matriz de diseño más simple contiene una columna, que corresponde a las etiquetas para la condición que se está probando. Otras covariables (también denominadas factores, características, etiquetas o parámetros) pueden incluir efectos de lote , artefactos conocidos y cualquier metadato que pueda confundir o mediar la expresión génica. Además de las covariables conocidas, las covariables desconocidas también pueden estimarse mediante enfoques de aprendizaje automático no supervisado, incluidos los análisis de componentes principales , variables sustitutas [ 85 ] y PEER [ 38 ] . Los análisis de variables ocultas se emplean a menudo para datos de RNA-Seq de tejido humano, que normalmente tienen artefactos adicionales no capturados en los metadatos ( por ejemplo , tiempo de isquemia, origen de múltiples instituciones, rasgos clínicos subyacentes, recopilación de datos a lo largo de muchos años con muchos personal).
  • Métodos: La mayoría de las herramientas utilizan regresión o estadísticas no paramétricas para identificar genes expresados ​​diferencialmente, y se basan en recuentos de lecturas mapeados a un genoma de referencia (DESeq2, limma, edgeR) o en recuentos de lecturas derivados de la cuantificación sin alineación (sleuth, [ 86 ] Cuffdiff, [ 87 ] Ballgown [ 88 ] ). [ 89 ] Después de la regresión, la mayoría de las herramientas emplean ajustes de valor p de tasa de error familiar (FWER) o tasa de descubrimiento falso (FDR) para tener en cuenta múltiples hipótesis (en estudios humanos, ~20 000 genes codificadores de proteínas o ~50 000 biotipos).
  • Resultados: Un resultado típico consta de filas que corresponden al número de genes y al menos tres columnas: el cambio logarítmico de expresión de cada gen ( transformación logarítmica de la razón de expresión entre las condiciones, una medida del tamaño del efecto ), el valor p y el valor p ajustado para comparaciones múltiples . Los genes se definen como biológicamente significativos si superan los umbrales de tamaño del efecto (cambio logarítmico) y significación estadística . Idealmente, estos umbrales deberían especificarse a priori , pero la naturaleza de los experimentos de RNA-Seq suele ser exploratoria, por lo que resulta difícil predecir los tamaños del efecto y los umbrales pertinentes con antelación.
  • Escollos: La razón de ser de estos métodos complejos es evitar la miríada de escollos que pueden llevar a errores estadísticos e interpretaciones engañosas. Los escollos incluyen tasas de falsos positivos aumentadas (debido a comparaciones múltiples), artefactos de preparación de muestras, heterogeneidad de muestras (como antecedentes genéticos mixtos), muestras altamente correlacionadas, diseños experimentales multinivel no considerados y un diseño experimental deficiente . Un escollo notable es ver los resultados en Microsoft Excel sin usar la función de importación para asegurar que los nombres de los genes permanezcan como texto. [ 90 ] Aunque conveniente, Excel convierte automáticamente algunos nombres de genes ( SEPT1 , DEC1 , MARCH2 ) en fechas o números de punto flotante.
  • Elección de herramientas y evaluación comparativa: Existen numerosos esfuerzos que comparan los resultados de estas herramientas, y DESeq2 tiende a superar moderadamente a otros métodos. [ 91 ] [ 92 ] [ 93 ] [ 94 ] [ 28 ] [ 89 ] [ 95 ] [ 96 ] Al igual que con otros métodos, la evaluación comparativa consiste en comparar las salidas de las herramientas entre sí y con estándares de oro conocidos .

Los análisis posteriores para una lista de genes diferencialmente expresados ​​se presentan en dos variantes: la validación de observaciones y la realización de inferencias biológicas. Debido a las limitaciones de la expresión diferencial y la secuenciación de ARN (RNA-Seq), las observaciones importantes se replican con (1) un método ortogonal en las mismas muestras (como la PCR en tiempo real ) o (2) otro experimento, a veces preregistrado , en una nueva cohorte. Este último ayuda a garantizar la generalización y, por lo general, puede complementarse con un metaanálisis de todas las cohortes agrupadas. El método más común para obtener una comprensión biológica de nivel superior de los resultados es el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes , aunque a veces se emplean enfoques de genes candidatos. El enriquecimiento de conjuntos de genes determina si la superposición entre dos conjuntos de genes es estadísticamente significativa; en este caso, la superposición entre genes diferencialmente expresados ​​y conjuntos de genes de vías/bases de datos conocidas ( por ejemplo , Gene Ontology , KEGG , Human Phenotype Ontology ) o de análisis complementarios en los mismos datos (como redes de coexpresión). Las herramientas comunes para el enriquecimiento de conjuntos de genes incluyen interfaces web ( por ejemplo , ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [ 97 ] y paquetes de software. Al evaluar los resultados del enriquecimiento, una heurística consiste en buscar primero el enriquecimiento de biología conocida como verificación de coherencia y luego ampliar el alcance para buscar biología novedosa.

Ejemplos de modos alternativos de empalme de ARN. Los exones están representados como bloques azules y amarillos, los intrones empalmados como líneas negras horizontales que conectan dos exones, y las uniones exón-exón como finas líneas grises que conectan dos exones.

Empalme alternativo

El empalme de ARN es integral para los eucariotas y contribuye significativamente a la regulación y diversidad de proteínas, ocurriendo en >90% de los genes humanos. [ 98 ] Hay múltiples modos de empalme alternativo : salto de exón (modo de empalme más común en humanos y eucariotas superiores), exones mutuamente excluyentes, sitios donadores o aceptores alternativos, retención de intrones (modo de empalme más común en plantas, hongos y protozoos), sitio de inicio de transcripción alternativo (promotor) y poliadenilación alternativa. [ 98 ] Un objetivo de RNA-Seq es identificar eventos de empalme alternativo y probar si difieren entre condiciones. La secuenciación de lectura larga captura el transcrito completo y, por lo tanto, minimiza muchos de los problemas en la estimación de la abundancia de isoformas, como el mapeo de lectura ambiguo. Para RNA-Seq de lectura corta, hay múltiples métodos para detectar el empalme alternativo que se pueden clasificar en tres grupos principales: [ 99 ] [ 71 ] [ 100 ]

  • Basado en recuentos (también basado en eventos, empalme diferencial): estima la retención de exones. Ejemplos: DEXSeq, [ 101 ] MATS, [ 102 ] y SeqGSEA. [ 103 ]
  • Basado en isoformas (también módulos de lectura múltiple, expresión diferencial de isoformas) : primero se estima la abundancia de isoformas y luego la abundancia relativa entre condiciones. Ejemplos de ello son Cufflinks 2 [ 104 ] y DiffSplice. [ 105 ]
  • Basado en la escisión de intrones: calcula el empalme alternativo utilizando lecturas divididas. Ejemplos de ello son MAJIQ [ 106 ] y Leafcutter. [ 100 ]

Las herramientas de expresión génica diferencial también pueden utilizarse para la expresión diferencial de isoformas si estas se cuantifican previamente con otras herramientas como RSEM. [ 107 ]

Redes de coexpresión

Las redes de coexpresión son representaciones derivadas de datos de genes que se comportan de manera similar en diferentes tejidos y condiciones experimentales. [ 108 ] Su propósito principal radica en la generación de hipótesis y enfoques de culpabilidad por asociación para inferir funciones de genes previamente desconocidos. [ 108 ] Los datos de RNA-Seq se han utilizado para inferir genes involucrados en vías específicas basadas en la correlación de Pearson , tanto en plantas [ 109 ] como en mamíferos . [ 110 ] La principal ventaja de los datos de RNA-Seq en este tipo de análisis sobre las plataformas de microarrays es la capacidad de cubrir todo el transcriptoma, lo que permite la posibilidad de desentrañar representaciones más completas de las redes reguladoras de genes. La regulación diferencial de las isoformas de empalme del mismo gen puede detectarse y utilizarse para predecir sus funciones biológicas. [ 111 ] [ 112 ] El análisis de redes de coexpresión de genes ponderadas se ha utilizado con éxito para identificar módulos de coexpresión y genes centrales intramodulares basados ​​en datos de RNA-Seq. Los módulos de coexpresión pueden corresponder a tipos celulares o vías. Los nodos intramodulares altamente conectados pueden interpretarse como representantes de su módulo respectivo. Un eigengene es una suma ponderada de la expresión de todos los genes en un módulo. Los eigengenes son biomarcadores (características) útiles para el diagnóstico y el pronóstico. [ 113 ] Se han propuesto enfoques de transformación estabilizadora de la varianza para estimar coeficientes de correlación basados ​​en datos de secuenciación de ARN. [ 109 ]

Descubrimiento de variantes

RNA-Seq captura variación de ADN, incluyendo variantes de un solo nucleótido , pequeñas inserciones/deleciones y variación estructural . La llamada de variantes en RNA-Seq es similar a la llamada de variantes de ADN y a menudo emplea las mismas herramientas (incluyendo SAMtools mpileup [ 114 ] y GATK HaplotypeCaller [ 115 ] ) con ajustes para tener en cuenta el empalme. Una dimensión única para las variantes de ARN es la expresión específica de alelo (ASE) : las variantes de un solo haplotipo pueden expresarse preferentemente debido a efectos reguladores incluyendo impronta y loci de rasgos cuantitativos de expresión y variantes raras no codificantes . [ 116 ] [ 117 ] Las limitaciones de la identificación de variantes de ARN incluyen que solo refleja regiones expresadas (en humanos, <5% del genoma), podría estar sujeta a sesgos introducidos por el procesamiento de datos (por ejemplo, los ensamblajes de transcriptoma de novo subestiman la heterocigosidad [ 118 ] ) y tiene una calidad inferior en comparación con la secuenciación directa de ADN.

Edición de ARN (alteraciones postranscripcionales)

Disponer de secuencias genómicas y transcriptómicas coincidentes de un individuo puede ayudar a detectar ediciones postranscripcionales ( edición de ARN ). [ 3 ] Se identifica un evento de modificación postranscripcional si el transcrito del gen tiene un alelo/variante que no se observa en los datos genómicos.

Un evento de fusión genética y el comportamiento de las lecturas de extremos emparejados que caen a ambos lados de la unión genética. Las fusiones genéticas pueden ocurrir en trans , entre genes en cromosomas separados, o en cis , entre dos genes en el mismo cromosoma.

detección de genes de fusión

Los genes de fusión, causados ​​por diferentes modificaciones estructurales en el genoma, han captado la atención debido a su relación con el cáncer. [ 119 ] La capacidad de la secuenciación de ARN (RNA-Seq) para analizar el transcriptoma completo de una muestra de manera imparcial la convierte en una herramienta atractiva para encontrar este tipo de eventos comunes en el cáncer. [ 4 ]

La idea surge del proceso de alinear las lecturas transcriptómicas cortas con un genoma de referencia. La mayoría de las lecturas cortas se ubicarán dentro de un exón completo, y se espera que un conjunto menor, pero aún considerable, se asigne a uniones exón-exón conocidas. Las lecturas cortas restantes no asignadas se analizarían posteriormente para determinar si coinciden con una unión exón-exón donde los exones provienen de genes diferentes. Esto sería evidencia de un posible evento de fusión; sin embargo, debido a la longitud de las lecturas, esto podría resultar muy impreciso. Un enfoque alternativo consiste en utilizar lecturas de extremos emparejados, donde un número potencialmente grande de lecturas emparejadas asignaría cada extremo a un exón diferente, lo que proporcionaría una mejor cobertura de estos eventos (véase la figura). No obstante, el resultado final consiste en múltiples combinaciones de genes, potencialmente novedosas, que proporcionan un punto de partida ideal para una validación posterior.

Análisis del número de copias

Los análisis de número de copias (CNA) se utilizan comúnmente en estudios oncológicos. La ganancia y la pérdida de genes tienen implicaciones en las vías de señalización y son un biomarcador clave de disfunción molecular en oncología. La obtención de información sobre CNA a partir de datos de RNA-Seq no es sencilla debido a las diferencias en la expresión génica, que dan lugar a variaciones en la profundidad de lectura de distinta magnitud entre genes. Debido a estas dificultades, la mayoría de estos análisis se realizan habitualmente mediante secuenciación del genoma completo/secuenciación del exoma completo (WGS/WES). Sin embargo, las herramientas bioinformáticas avanzadas permiten obtener información sobre CNA a partir de datos de RNA-Seq. [ 9 ]

Descubrimiento de biomarcadores

La secuenciación de ARN (RNA-Seq) tiene el potencial de identificar nuevos aspectos de la biología de enfermedades, perfilar biomarcadores para indicaciones clínicas, inferir vías susceptibles de ser moduladas farmacológicamente y realizar diagnósticos genéticos. [ 120 ] [ 121 ] Estos resultados podrían personalizarse aún más para subgrupos o incluso pacientes individuales, lo que podría permitir una prevención, un diagnóstico y una terapia más eficaces. La viabilidad de este enfoque está determinada en parte por los costos en dinero y tiempo; una limitación relacionada es el equipo de especialistas necesario (bioinformáticos, médicos/clínicos, investigadores básicos, técnicos) para interpretar completamente la enorme cantidad de datos generados por este análisis. [ 122 ]

Multiómica

Se ha dado mucha importancia a los datos de RNA-Seq después de que los proyectos Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) y The Cancer Genome Atlas (TCGA) utilizaran este enfoque para caracterizar docenas de líneas celulares [ 123 ] y miles de muestras de tumores primarios, [ 124 ] respectivamente. ENCODE tenía como objetivo identificar regiones reguladoras en todo el genoma en diferentes cohortes de líneas celulares y los datos transcriptómicos son primordiales para comprender el efecto posterior de esas capas reguladoras epigenéticas y genéticas. TCGA, en cambio, tenía como objetivo recolectar y analizar miles de muestras de pacientes de 30 tipos diferentes de tumores para comprender los mecanismos subyacentes de la transformación y progresión maligna. En este contexto, los datos de RNA-Seq proporcionan una instantánea única del estado transcriptómico de la enfermedad y observan una población imparcial de transcritos que permite la identificación de nuevos transcritos, transcritos de fusión y ARN no codificantes que podrían pasar desapercibidos con otras tecnologías.

Otros análisis y aplicaciones emergentes

Las aplicaciones de RNA-Seq crecen día a día. Otras nuevas aplicaciones de RNA-Seq incluyen la detección de contaminantes microbianos, [ 125 ] la determinación de la abundancia de tipos celulares (deconvolución de tipos celulares), [ 9 ] la medición de la expresión de TE y la predicción de neoantígenos, etc. [ 9 ]

Véase también

Referencias

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Lecturas adicionales

  • Taguchi Y (2019). "Análisis transcriptómico comparativo". Enciclopedia de bioinformática y biología computacional . págs. 814–818 . doi : 10.1016/B978-0-12-809633-8.20163-5 . ISBN  978-0-12-811432-2. S2CID 65302519 . 
  • Cresko B, Voelker R, Small C (2001). Bassham S, Catchen J (eds.). "RNA-seqlopedia" . Universidad de Oregón.: una guía de alto nivel para diseñar e implementar un experimento de secuenciación de ARN (RNA-Seq).
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