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Número de integridad del ARN

El índice de integridad del ARN (RIN, por sus siglas en inglés) es un algoritmo para asignar valores de integridad a las mediciones de ARN . La integridad del ARN es una preocup...

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El índice de integridad del ARN (RIN, por sus siglas en inglés) es un algoritmo para asignar valores de integridad a las mediciones de ARN .

La integridad del ARN es una preocupación importante para los estudios de expresión génica y tradicionalmente se ha evaluado utilizando la relación 28S / 18S rRNA , un método que ha demostrado ser inconsistente. [ 1 ] Esta inconsistencia surge porque se requiere una interpretación subjetiva y humana para comparar las imágenes de gel 28S y 18S . El algoritmo RIN se diseñó para superar este problema. El algoritmo RIN se aplica a mediciones electroforéticas de ARN, generalmente obtenidas mediante electroforesis capilar en gel, y se basa en una combinación de diferentes características que aportan información sobre la integridad del ARN para proporcionar una medida más universal. Se ha demostrado que RIN es robusto y reproducible en estudios que lo comparan con otros algoritmos de cálculo de la integridad del ARN, consolidando su posición como método preferido para determinar la calidad del ARN que se va a analizar. [ 2 ]

Una crítica importante al RIN surge al usarlo con plantas o en estudios de interacciones entre células eucariotas y procariotas. El algoritmo RIN no puede diferenciar el ARN ribosómico eucariota , procariota o cloroplástico , lo que genera una subestimación significativa del índice de calidad en tales situaciones.

Otra limitación es que el RIN refleja la integridad de los ARN ribosómicos, que tienen una estabilidad bastante diferente a la de los ARNm y los microARN, que son biomarcadores más interesantes.Una alternativa es determinar la estabilidad del ARN objetivo o de un ARNm representativo directamente utilizando el método de amplicón diferencial (△△Amp) desarrollado por el proyecto europeo SPIDIA .

Terminología

La electroforesis es el proceso de separar especies de ácidos nucleicos según su longitud mediante la aplicación de un campo eléctrico . Dado que los ácidos nucleicos tienen carga negativa, el campo eléctrico los empuja a través de una matriz, generalmente un gel de agarosa , y las moléculas más pequeñas se desplazan más lejos y más rápido. [ 3 ] La electroforesis capilar es una técnica que permite analizar pequeñas cantidades de una muestra de ácido nucleico en un gel dentro de un tubo muy delgado. El equipo cuenta con un detector que indica cuándo las muestras de ácido nucleico pasan por un punto específico del tubo, siendo las muestras más pequeñas las que pasan primero. Esto permite obtener un electroferograma como el de la Figura 1, donde la longitud se relaciona con el tiempo en que las muestras pasan por el detector.

Un marcador es una muestra de tamaño conocido que se utiliza junto con la muestra para que se pueda conocer el tamaño real del resto de la muestra comparando su distancia/tiempo de carrera con respecto a este marcador.

El ARN es una macromolécula biológica compuesta de azúcares y bases nitrogenadas que desempeña funciones cruciales en todas las células vivas. Existen varios subtipos de ARN, siendo los más abundantes en la célula el ARNt (ARN de transferencia), el ARNr (ARN ribosómico) y el ARNm (ARN mensajero). Los tres participan en el proceso de traducción , siendo el ARNr la especie más abundante (~85%) del ARN celular. Por consiguiente, es la especie más visible al analizar el ARN mediante electroforesis y, por lo tanto, se utiliza para determinar su calidad (véase Cálculo, más adelante). El ARNr se presenta en diversos tamaños; en mamíferos, los tamaños son 5S, 18S y 28S. Los ARNr 28S y 5S forman la subunidad grande y el 18S la subunidad pequeña del ribosoma , la maquinaria molecular responsable de la síntesis de proteínas. [ 4 ]

Aplicaciones

Las RNasas son omnipresentes y a menudo pueden contaminar y degradar muestras de ARN en el laboratorio, por lo que la integridad del ARN puede verse comprometida fácilmente, lo que ha dado lugar a diversas técnicas de laboratorio diseñadas para eliminar su impacto. [ 5 ] [ 6 ] Sin embargo, estos métodos no son infalibles, por lo que las muestras aún pueden degradarse, lo que requiere un método para medir la integridad del ARN que garantice la fiabilidad y la reproducibilidad de los ensayos moleculares, ya que la integridad del ARN es fundamental para obtener resultados adecuados en estudios de expresión génica, como el análisis de microarrays, los Northern blots o la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR). [ 7 ] [ 8 ] El ARN degradado tiene un impacto directo en los niveles de expresión calculados, lo que a menudo conduce a una disminución significativa de la expresión aparente. [ 9 ]

La qPCR y técnicas similares son muy costosas, ya que requieren mucho tiempo y dinero, por lo que se siguen realizando investigaciones para reducir los costos manteniendo la precisión y la reproducibilidad de la qPCR para la expresión génica y otras aplicaciones. [ 10 ] La evaluación RIN permite a un científico evaluar la fiabilidad y la reproducibilidad de un experimento antes de incurrir en costos sustanciales al realizar estudios de expresión génica.

RIN es un método estándar para medir la integridad del ARN y puede utilizarse para evaluar la calidad del ARN producido por nuevas técnicas de aislamiento de ARN. [ 11 ]

Desarrollo

Como la integridad del ARN ha sido un problema conocido desde hace mucho tiempo en los estudios de biología molecular , existen algunos métodos que se han utilizado históricamente para determinar la integridad del ARN. El más popular ha sido durante mucho tiempo la electroforesis en gel de agarosa con tinción de bromuro de etidio , que permite visualizar las bandas de los picos de ARNr. La altura de las bandas 28S y 18S se puede comparar entre sí, y una proporción de 2:1 indica ARN no degradado. [ 1 ] Si bien este método es muy económico y fácil, tiene varios problemas, principalmente su subjetividad, que lleva a evaluaciones de calidad del ARN inconsistentes y no estandarizadas, y las grandes cantidades de ARN que se necesitan para visualizarlo en un gel de agarosa, lo que puede ser problemático si no hay mucho ARN con el que trabajar. [ 1 ] [ 12 ] También existen varios problemas diferentes que pueden surgir de la electroforesis en gel de agarosa, como una carga deficiente, un funcionamiento irregular y una tinción irregular que conducen a una mayor variabilidad en la precisión del uso de la electroforesis en gel de agarosa para determinar la integridad del ARN. [ 13 ]

El número de integridad del ARN fue desarrollado por Agilent Technologies en 2005. [ 1 ] El algoritmo se generó tomando cientos de muestras y haciendo que especialistas les asignaran manualmente un valor de 1 a 10 en función de su integridad, siendo 10 el valor más alto. Se utilizaron herramientas de aprendizaje adaptativo que emplean una técnica de aprendizaje bayesiano para generar un algoritmo que pudiera predecir el RIN, principalmente mediante el uso de las características que se enumeran a continuación en "Cálculo". [ 1 ] [ 14 ] Esto permite que todo el software de Agilent produzca el mismo RIN para una muestra de ARN dada, estandarizando la medición y haciéndola mucho menos subjetiva que los métodos anteriores .

Cálculo

Figura 1. Trazado de electroferograma idealizado con un RIN aproximado de 10. A la derecha se muestra un ejemplo del aspecto que tendría el análisis de una muestra de ARN celular en una de las calles de un gel de agarosa. A la izquierda se muestra una versión idealizada y etiquetada del trazado de electroferograma que podría generar dicho gel. En un electroferograma real, habría muchos picos pequeños, especialmente en la región rápida correspondiente a los ARNm, pero estos no se han incluido para mayor claridad.
Figura 2. Un trazado de electroferograma idealizado que tendría un RIN de aproximadamente 1 o 2. A diferencia de la Figura 1, donde los picos 28S y 18S son muy grandes, aquí se han reducido y la mayor parte de la muestra se encuentra a la izquierda, más cerca de donde se ubicaba originalmente el marcador. El tamaño promedio de los ARN se ha reducido claramente, lo que indica un ARN de baja calidad.

El RIN para una muestra se calcula utilizando varias características de un trazado de electroferograma de ARN, siendo las dos primeras que se enumeran a continuación las más significativas. El RIN asigna a un electroferograma un valor de 1 a 10, donde 10 representa la menor degradación. Todas las descripciones siguientes se aplican al ARN de mamíferos porque los ARN de otras especies tienen diferentes tamaños de ARNr: [ 1 ] La proporción total de ARN se calcula tomando la proporción del área bajo los picos de ARNr 18S y 28S con respecto al área total bajo el gráfico; se desea un número alto en este caso, lo que indica que gran parte del ARNr todavía se encuentra en estos tamaños y, por lo tanto, ha ocurrido poca o ninguna degradación. Una proporción ideal se puede observar en la figura 1, donde casi todo el ARN se encuentra en los picos de ARN 18S y 28S.

Para la altura del pico 28S, se busca un valor elevado. El 28S, la especie de ARNr más prominente, se utiliza en el cálculo del RIN, ya que suele degradarse más rápidamente que el ARNr 18S; por lo tanto, medir la altura de su pico permite detectar las primeras etapas de degradación. Esto se observa en la figura 1, donde el pico 28S es el más alto, lo cual es positivo.

La región rápida es el área comprendida entre los picos de ARNr 18S y 5S en un electroferograma. Inicialmente, a medida que aumenta el valor de la relación del área rápida, indica la degradación del ARNr 18S y 28S a un tamaño intermedio, aunque posteriormente la relación disminuye a medida que el ARN se degrada aún más, hasta tamaños aún menores. Por lo tanto, un valor bajo no indica necesariamente una buena o mala integridad del ARN.

Se desea una altura de marcador pequeña, lo que indica que solo pequeñas cantidades de ARN se han degradado y han pasado a longitudes más pequeñas, indicadas por el marcador corto. Si se encuentra un número grande aquí, eso indica que grandes cantidades de ARNr se han degradado a pequeños fragmentos que se encontrarían más cerca de este marcador. Esta situación se puede ver en el electroferograma de ARN de "mala calidad" que se encuentra en la figura 2, donde la altura del pico sobre el marcador (extremo izquierdo) es muy grande, por lo que el ARN se ha degradado mucho. En muestras procariotas, el algoritmo es algo diferente, pero el software Agilent 2100 Bioanalyzer Expert ahora también puede calcular RIN para muestras procariotas. [ 15 ] La diferencia probablemente surge del hecho de que, mientras que las muestras de mamíferos tienen ARN ribosómicos 28S y 18S como sus especies predominantes, los ARN procariotas tienen tamaños ligeramente más pequeños, a 23S y 16S, por lo que el algoritmo debe ajustarse para acomodar eso. Otro hecho crucial sobre el cálculo de los números de integridad del ARN procariota es que el RIN no ha sido validado en la misma medida que para el ARN eucariota. [ 15 ] Se ha demostrado que valores de RIN más altos se correlacionan con mejores resultados posteriores en eucariotas, pero esto no se ha hecho tan extensamente para procariotas, por lo que puede significar menos en procariotas.

Estos electroferogramas para calcular el RIN se realizan utilizando el bioanalizador Agilent, que es capaz de realizar electroforesis y generar los electroferogramas. [ 14 ] El software Agilent 2100 es el único capaz de realizar el cálculo del RIN, ya que el algoritmo exacto es propietario, por lo que existen características adicionales importantes del electroferograma de ARN que se utilizan en su cálculo y que no están disponibles públicamente.

Referencias

  1. 1 2 3 4 5 6 Schroeder, Andreas; Mueller, Odilo; Stocker, Susanne; Salowsky, Ruediger; Leiber, Michael; Gassmann, Marcus; Lightfoot, Samar; Menzel, Wolfram; Granzow, Martin; Ragg, Thomas (2006). "El RIN: un número de integridad del ARN para asignar valores de integridad a las mediciones de ARN" . BMC Molecular Biology . 7 (1): 3. doi : 10.1186/1471-2199-7-3 . PMC 1413964. PMID 16448564 .  
  2. ↑ Imbeaud, Sandrine; Graudens, Esther; Boulanger, Virginie; Barlet, Xavier; Zaborski, Patrick; Eveno, Eric; Mueller, Odilo; Schroeder, Andreas; Auffray, Charles (2005-01-01). "Hacia la estandarización de la evaluación de la calidad del ARN utilizando clasificadores independientes del usuario de trazas de electroforesis microcapilar" . Nucleic Acids Research . 33 (6): e56. doi : 10.1093/nar/gni054 . ISSN 0305-1048 . PMC 1072807. PMID 15800207 .   
  3. ↑ Watson, James D.; Baker, Tania A.; Bell, Stephen P.; Gann, Alexander; Levine, Michael; Losick, Richard (2014). Biología molecular del gen: Séptima edición . Glenview, IL: Pearson Education. ISBN 978-0-321-85149-9.
  4. ^ Khatter, Heena; Myasnikov, Alexander G.; Natchiar, S. Kundhavai; Klaholz, Bruno P. (2015). "Estructura del ribosoma 80S humano". Naturaleza . 520 (7549): 640– 645. Bibcode : 2015Natur.520..640K . doi : 10.1038/naturaleza14427 . PMID 25901680 . S2CID 4459012 .  
  5. ↑ "Cómo evitar la contaminación por ribonucleasa | NEB" . www.neb.com . Consultado el 10 de abril de 2016 .
  6. ↑ "Lo básico: Control de la RNasa" . www.thermofisher.com . Consultado el 10 de abril de 2016 .
  7. ↑ Bustin, Stephen A.; Benes, Vladimir; Garson, Jeremy A.; Hellemans, Jan; Huggett, Jim; Kubista, Mikael; Mueller, Reinhold; Nolan, Tania; Pfaffl, Michael W. (2009-04-01). "Las directrices MIQE: Información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real" . Química Clínica . 55 (4): 611– 622. doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . ISSN 0009-9147 . PMID 19246619 .  
  8. ↑ Fleige, Simone; Pfaffl, Michael W. (2006). "Integridad del ARN y su efecto en el rendimiento de la PCR cuantitativa en tiempo real". Aspectos moleculares de la medicina . 27 ( 2– 3): 126– 139. doi : 10.1016/j.mam.2005.12.003 . PMID 16469371 . 
  9. ↑ Taylor, Sean C.; Mrkusich, Eli M. (2014). "El estado de la RT-PCR cuantitativa: observaciones de primera mano sobre la implementación de la información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real (MIQE)" . Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology . 24 (1): 46– 52. doi : 10.1159/000356189 . PMID 24296827 . 
  10. ↑ Reitschuler, Christoph; Lins, Philipp; Illmer, Paul (2014). "Evaluación y adaptación de cebadores para una PCR cuantitativa basada en SYBR Green rentable y su aplicabilidad para la cuantificación específica de metanógenos". World Journal of Microbiology and Biotechnology . 30 (1): 293– 304. doi : 10.1007/s11274-013-1450-x . PMID 23918633 . S2CID 36790110 .  
  11. ↑ Livingston, Whitney S.; Rusch, Heather L.; Nersesian, Paula V.; Baxter, Tristin; Mysliwiec, Vincent; Gill, Jessica M. (2015-01-01). "La mejora del sueño en el personal militar se asocia con cambios en la expresión de genes inflamatorios y una mejora en los síntomas de depresión" . Frontiers in Psychiatry . 6 : 59. doi : 10.3389/fpsyt.2015.00059 . PMC 4415307. PMID 25983695 .  
  12. ↑ Taylor, Sean; Wakem, Michael; Dijkman, Greg; Alsarraj, Marwan; Nguyen, Marie (2010-04-01). "Un enfoque práctico para RT-qPCR: publicación de datos que se ajustan a las directrices MIQE". Methods . The continuous Evolution of qPCR. 50 (4): S1– S5. doi : 10.1016/j.ymeth.2010.01.005 . PMID 20215014 . 
  13. ↑ "Avance en la metodología de control de calidad para evaluar el ARN total aislado y el cRNA fragmentado generado", Nota de aplicación de Agilent, número de publicación 5988-9861EN, 2003.
  14. 1 2 "Número de integridad del ARN (RIN) – Estandarización del control de calidad del ARN", Nota de aplicación de Agilent, número de publicación 5989-1165EN, 2016.
  15. 1 2 Agilent 2100 Bioanalyzer: Guía del usuario experto del 2100. Waldbronn, Alemania: Agilent Technologies (2005).
  • Información RIN de Agilent Technologies
  • Artículo de RIN en BMC Molecular Biology
  • Resumen de la expresión génica de Nature para ayudar a mostrar por qué necesitamos RIN.
  • Explicación de RIN por parte de Agilent Technologies, con varios ejemplos de electroferogramas a diferentes valores de RIN.
  • Simulación de electroforesis en gel de la Universidad de Utah para ayudar a visualizar cómo se producen los electroferogramas.