Secuencia BRB

La secuenciación y codificación de ARN masiva ( BRB-seq ) es una tecnología de secuenciación de ARNm 3' masiva de ultra alto rendimiento que utiliza codificación de muestras en etapa temprana e identificadores moleculares únicos (UMI) para permitir la agrupación de hasta 384 muestras en un tubo al inicio del flujo de trabajo de preparación de la biblioteca de secuenciación. Esta tecnología transcriptómica es compatible con los instrumentos de secuenciación de lectura corta de Illumina y MGI . ^{[ 1 ]}

En la secuenciación de ARN estándar , se debe preparar una biblioteca de secuenciación para cada muestra de ARN individualmente. ^{[ 2 ]} En cambio, en la secuenciación BRB, todas las muestras se agrupan al principio del flujo de trabajo para su procesamiento simultáneo, lo que reduce el costo y el tiempo de manipulación asociados con la etapa de preparación de la biblioteca. ^{[ 1 ]}

Como BRB-seq es una técnica de secuenciación de ARNm 3', se generan lecturas cortas solo para la región 3' de las moléculas de ARNm poliadenilado en lugar de la longitud completa de los transcritos como en la secuenciación de ARN estándar . Esto significa que BRB-seq requiere una profundidad de secuenciación mucho menor por muestra para generar datos transcriptómicos de todo el genoma que permiten a los usuarios detectar un número similar de genes expresados ​​y genes diferencialmente expresados ​​que el enfoque estándar Illumina TruSeq, pero a un costo hasta 25 veces más barato o similar al perfilado de cuatro genes usando RT-qPCR . ^{[ 1 ]} BRB-seq también tiene una mayor tolerancia a la baja calidad del ARN (RIN <6) donde los transcritos están degradados porque solo se requiere la región 3' en la preparación de la biblioteca ^{[ 1 ]}

La técnica BRB-seq se publicó por primera vez en abril de 2019 en la revista revisada por pares Genome Research en un manuscrito titulado 'BRB-seq: transcriptómica de alto rendimiento ultra asequible habilitada por codificación de barras y secuenciación de ARN masivo'. ^{[ 1 ]} A finales de 2019, el artículo se encontraba entre los 10 artículos más leídos de la revista y ha sido citado más de 150 veces ^{[ 3 ]} (abril de 2024).

La técnica se desarrolló en la École Polytechnique Fédérale de Lausanne en Suiza, en los laboratorios del profesor Bart Deplancke y sus colaboradores. En mayo de 2020, se fundó la empresa Alithea Genomics para ofrecer BRB-seq en forma de kits para investigadores o como un servicio completo. ^{[ 4 ]} BRB-seq se basa en los avances tecnológicos de la transcriptómica de células individuales , donde el código de barras de las muestras hizo posible la multiplexación temprana de cientos o miles de células individuales. La multiplexación de muestras permitió a los investigadores crear bibliotecas de secuenciación únicas que contenían múltiples muestras distintas, reduciendo los costos experimentales generales y el tiempo de manipulación, al tiempo que aumentaba drásticamente el rendimiento. ^{[ 5 ]}

BRB-seq aplica estos avances en el código de barras de muestras y ARNm a los ARNm derivados de poblaciones celulares masivas para permitir estudios de ultra alto rendimiento cruciales para el descubrimiento de fármacos , estudios de población o investigación fundamental . ^{[ 1 ] [ 6 ]}

El aspecto fundamental de BRB-seq son los cebadores de código de barras de muestra optimizados. Cada secuencia de nucleótidos con código de barras incluye un adaptador para la hibridación del cebador, un código de barras de 14 nt que asigna un identificador único a cada muestra de ARN individual y un UMI aleatorio de 14 nt que etiqueta cada molécula de ARNm con una secuencia única para distinguir entre los transcritos de ARNm originales y los duplicados que resultan del sesgo de amplificación por PCR. BRB-seq permite agrupar hasta 384 muestras de ARN con código de barras individuales en un solo tubo al inicio del flujo de trabajo para optimizar los pasos posteriores en la preparación de la biblioteca de ADNc y la secuenciación. ^{[ 1 ] [ 7 ] [ 8 ]}

Requisitos de ARN de entrada

Las muestras de ARN total aislado requieren un RIN ≥ 6 y una relación A260/230 > 1,5 cuando se cuantifican con Nanodrop.  Se recomienda entre 10 ng y 1 μg de ARN purificado por muestra para la secuenciación BRB estándar. Para garantizar la uniformidad de la biblioteca y una distribución uniforme de las lecturas para cada muestra después de la secuenciación, la concentración de ARN por muestra de entrada, su RIN y sus valores 260/230 deben ser lo más uniformes posible. ^{[ 1 ]}

Flujo de trabajo

El flujo de trabajo de BRB-seq comienza añadiendo muestras de ARN aisladas a pocillos individuales de una placa de 96 o 384 pocillos. A continuación, cada muestra se somete a una transcripción inversa independiente con código de barras tras la adición de cebadores oligo(dT) optimizados y con código de barras. Estos cebadores marcan de forma única la cola poli(A) 3' de las moléculas de ARNm durante la síntesis de la primera cadena de ADNc. La información de la cadena se conserva. Dado que cada muestra de ARN tiene un código de barras individual, todas las muestras de la placa de 96 o 384 pocillos pueden combinarse en un solo tubo para su procesamiento simultáneo tras este primer paso.

Tras agrupar las muestras en un solo tubo, se digieren los cebadores libres. A continuación, una reacción de síntesis de la segunda cadena da como resultado ADNc de doble cadena (ADNc DS).

A continuación, estas moléculas de ADNc de longitud completa se someten a un proceso denominado tagmentación, facilitado por la transposasa Tn5 , que contiene adaptadores necesarios para la amplificación de la biblioteca. La transposasa primero fragmenta las moléculas de ADNc y luego liga los adaptadores a estos fragmentos. Se obtiene una mayor complejidad de la biblioteca al utilizar aproximadamente 20  ng de ADNc por muestra para la tagmentación, lo que implica un menor número de ciclos de amplificación por PCR.

Para garantizar la compatibilidad con los secuenciadores Illumina, la biblioteca de ADNc resultante se indexa y amplifica mediante una estrategia única de indexación dual (UDI) con los índices P5 y P7. Estos índices minimizan el riesgo de asignación errónea de códigos de barras tras la secuenciación de nueva generación.

Posteriormente, se requiere información sobre el tamaño promedio de los fragmentos de las bibliotecas para evaluar su molaridad y preparar la dilución adecuada para la secuenciación. Una biblioteca exitosa contiene fragmentos de entre 300 y 1000 pb, con un pico de entre 400 y 700 pb.

A diferencia de los métodos estándar de secuenciación masiva de ARN (RNA-seq), que requieren alrededor de 30 millones de lecturas por muestra para obtener información fiable sobre la expresión génica , en BRB-seq una profundidad de secuenciación de entre uno y cinco millones de lecturas por muestra es suficiente para detectar la mayoría de los genes expresados ​​en una muestra. Los genes con baja expresión pueden detectarse mediante una mayor profundidad de secuenciación.

Los datos de secuenciación BRB-seq se pueden analizar con métodos estándar de análisis transcriptómico de código abierto, como STARsolo, diseñados para alinear datos multiplexados y generar matrices de recuento de genes y UMI para el análisis posterior de RNA-seq a partir de archivos fastq sin procesar.

BRB-seq es adecuado para cualquier estudio que requiera datos transcriptómicos de todo el genoma. Es especialmente apropiado para estudios con cientos o miles de muestras gracias a su flujo de trabajo escalable, sencillo y rápido, que permite la automatización.