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Secuenciación de células individuales

La secuenciación de células individuales examina la información de la secuencia de ácidos nucleicos de células individuales con tecnologías de secuenciación de próxima generació...

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La secuenciación de células individuales examina la información de la secuencia de ácidos nucleicos de células individuales con tecnologías de secuenciación de próxima generación optimizadas, lo que proporciona una mayor resolución de las diferencias celulares y una mejor comprensión de la función de una célula individual en el contexto de su microambiente. [ 1 ] Por ejemplo, en el cáncer, la secuenciación del ADN de células individuales puede proporcionar información sobre mutaciones que portan pequeñas poblaciones de células. En el desarrollo, la secuenciación de los ARN expresados ​​por células individuales puede dar información sobre la existencia y el comportamiento de diferentes tipos de células. [ 2 ] En sistemas microbianos, una población de la misma especie puede parecer genéticamente clonal. Sin embargo, la secuenciación de células individuales de ARN o modificaciones epigenéticas puede revelar la variabilidad célula a célula que puede ayudar a las poblaciones a adaptarse rápidamente para sobrevivir en entornos cambiantes. [ 3 ]

Fondo

Una célula humana típica contiene aproximadamente 2 x 3,3 mil millones de pares de bases de ADN y 600 millones de bases de ARNm. Por lo general, se utiliza una mezcla de millones de células para secuenciar el ADN o el ARN mediante métodos tradicionales como la secuenciación de Sanger o la secuenciación de nueva generación . Mediante la secuenciación profunda de ADN y ARN de una sola célula, se pueden investigar exhaustivamente las funciones celulares. [ 1 ] Al igual que los experimentos típicos de secuenciación de nueva generación, los protocolos de secuenciación de células individuales generalmente incluyen los siguientes pasos: aislamiento de una sola célula, extracción y amplificación de ácidos nucleicos , preparación de la biblioteca de secuenciación , secuenciación y análisis de datos bioinformáticos . La secuenciación de células individuales es más compleja que la secuenciación de células en masa. La mínima cantidad de material de partida de una sola célula hace que la degradación, la pérdida de muestra y la contaminación tengan efectos pronunciados en la calidad de los datos de secuenciación. Además, debido al nivel de picogramos del número de ácidos nucleicos utilizados, [ 4 ] a menudo se necesita una amplificación intensa durante la preparación de muestras para la secuenciación de células individuales, lo que da como resultado una cobertura desigual, ruido y una cuantificación inexacta de los datos de secuenciación.

Las recientes mejoras técnicas convierten a la secuenciación de células individuales en una herramienta prometedora para abordar una serie de problemas aparentemente inaccesibles. Por ejemplo, muestras heterogéneas, tipos celulares raros, relaciones de linaje celular, mosaicismo de tejidos somáticos, análisis de microbios que no se pueden cultivar y la evolución de enfermedades pueden dilucidarse mediante la secuenciación de células individuales. [ 5 ] La secuenciación de células individuales fue seleccionada como el método del año 2013 por Nature Publishing Group. [ 6 ]

Secuenciación del genoma (ADN)

La secuenciación del genoma de ADN de células individuales implica aislar una sola célula, amplificar el genoma completo o la región de interés, construir bibliotecas de secuenciación y luego aplicar la secuenciación de ADN de próxima generación (por ejemplo, Illumina , Ion Torrent ). La secuenciación de ADN de células individuales se ha aplicado ampliamente en sistemas de mamíferos para estudiar la fisiología normal y las enfermedades. La resolución de célula individual puede descubrir los roles del mosaicismo genético o la heterogeneidad genética intratumoral en el desarrollo del cáncer o la respuesta al tratamiento. [ 7 ] En el contexto de los microbiomas, un genoma de un solo organismo unicelular se denomina genoma amplificado único (SAG). Los avances en la secuenciación de ADN de células individuales han permitido recopilar datos genómicos de especies procariotas no cultivadas presentes en microbiomas complejos. [ 8 ]  Aunque los SAG se caracterizan por una baja completitud y un sesgo significativo, los avances computacionales recientes han logrado el ensamblaje de genomas casi completos a partir de SAG compuestos. [ 9 ] Los datos obtenidos de microorganismos podrían establecer procesos para el cultivo en el futuro. [ 10 ] Algunas de las herramientas de ensamblaje del genoma utilizadas en la secuenciación de células individuales incluyen SPAdes , IDBA-UD, Cortex y HyDA. [ 11 ]

Métodos

Esta figura ilustra el flujo de trabajo de la secuenciación del genoma de células individuales. MDA significa Amplificación por Desplazamiento Múltiple.

Se ha publicado una lista de más de 100 métodos ómicos de células individuales diferentes . [ 12 ]

La amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) es una técnica ampliamente utilizada que permite amplificar femtogramos de ADN bacteriano hasta microgramos para secuenciación. Los reactivos necesarios para las reacciones de MDA incluyen: cebadores aleatorios y ADN polimerasa del bacteriófago phi29. En una reacción isotérmica a 30 grados, el ADN se amplifica con los reactivos incluidos. A medida que las polimerasas fabrican nuevas hebras, tiene lugar una reacción de desplazamiento de hebra, sintetizando múltiples copias de cada ADN molde. Al mismo tiempo, las hebras que se extendieron previamente se desplazarán. Los productos de MDA resultan en una longitud de aproximadamente 12 kb y alcanzan hasta alrededor de 100 kb, lo que permite su uso en la secuenciación de ADN. [ 10 ] En 2017, se introdujo una mejora importante de esta técnica, llamada WGA-X, aprovechando un mutante termoestable de la polimerasa phi29, lo que condujo a una mejor recuperación del genoma de células individuales, en particular aquellas con alto contenido de G+C . [ 13 ] MDA también se ha implementado en un sistema microfluídico basado en gotas para lograr una amplificación del genoma completo de células individuales altamente paralelizada. Al encapsular células individuales en gotas para la captura y amplificación del ADN, este método ofrece un sesgo reducido y un rendimiento mejorado en comparación con MDA convencional. [ 14 ]

Otro método común es MALBAC . [ 15 ] Al igual que en MDA, este método comienza con una amplificación isotérmica, pero los cebadores están flanqueados por una secuencia "común" para la posterior amplificación por PCR . A medida que se generan los amplicones preliminares, la secuencia común promueve la autoligación y la formación de "bucles" para evitar una mayor amplificación. A diferencia de MDA, no se forma la red de ADN altamente ramificada. En cambio, los bucles se desnaturalizan en otro ciclo de temperatura, lo que permite que los fragmentos se amplifiquen mediante PCR. MALBAC también se ha implementado en un dispositivo microfluídico, pero el rendimiento de la amplificación no mejoró significativamente con la encapsulación en gotas de nanolitros. [ 16 ]

Al comparar MDA y MALBAC, MDA ofrece una mejor cobertura del genoma, pero MALBAC proporciona una cobertura más uniforme. MDA podría ser más eficaz para identificar SNP , mientras que MALBAC se prefiere para detectar variantes del número de copias. Si bien realizar MDA con un dispositivo microfluídico reduce notablemente el sesgo y la contaminación, la química involucrada en MALBAC no demuestra el mismo potencial para mejorar la eficiencia.

Un método particularmente adecuado para el descubrimiento de variación estructural genómica es la secuenciación de la cadena de ADN de una sola célula (también conocida como Strand-seq). [ 17 ] Utilizando el principio del procesamiento tricanal de una sola célula, que emplea el modelado conjunto de la orientación de lectura, la profundidad de lectura y la fase del haplotipo, Strand-seq permite el descubrimiento de todo el espectro de clases de variación estructural somática de ≥200 kb de tamaño. Strand-seq supera las limitaciones de los métodos basados ​​en la amplificación del genoma completo para la identificación de clases de variación genética somática en células individuales, [ 18 ] porque no es susceptible a quimeras de lectura que conducen a artefactos de llamada (discutido en detalle en la sección siguiente) y se ve menos afectado por pérdidas. La elección del método depende del objetivo de la secuenciación, ya que cada método presenta diferentes ventajas. [ 7 ]

Limitaciones

La amplificación multivariante (MDA) de genomas celulares individuales produce una cobertura genómica muy desigual, es decir, una sobreamplificación y subamplificación relativa de diversas regiones de la plantilla, lo que conlleva la pérdida de algunas secuencias. Este proceso consta de dos componentes: a) sobreamplificación y subamplificación estocástica de regiones aleatorias; y b) sesgo sistemático contra las regiones con alto %GC. El componente estocástico puede abordarse agrupando las reacciones de MDA de células individuales del mismo tipo celular, empleando hibridación fluorescente in situ (FISH) y/o confirmación posterior a la secuenciación. [ 10 ] El sesgo de la MDA contra las regiones con alto %GC puede abordarse utilizando polimerasas termoestables, como en el proceso denominado WGA-X. [ 13 ]

Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), que constituyen una parte importante de la variación genética en el genoma humano , y la variación del número de copias (CNV) plantean problemas en la secuenciación de células individuales, así como la cantidad limitada de ADN extraído de una sola célula. Debido a la escasa cantidad de ADN, el análisis preciso del mismo presenta problemas incluso después de la amplificación, ya que la cobertura es baja y susceptible a errores. Con MDA, la cobertura genómica promedio es inferior al 80%, y los SNP que no están cubiertos por las lecturas de secuenciación se descartan. Además, MDA muestra una alta tasa de pérdida de alelos , al no detectar alelos de muestras heterocigotas. Actualmente se utilizan varios algoritmos de SNP, pero ninguno es específico para la secuenciación de células individuales. MDA con CNV también plantea el problema de identificar CNV falsos que ocultan los CNV reales. Para resolver esto, cuando se pueden generar patrones a partir de CNV falsos, los algoritmos pueden detectar y erradicar este ruido para producir variantes verdaderas. [ 19 ]

Strand-seq supera las limitaciones de los métodos basados ​​en la amplificación del genoma completo para la detección de variantes genéticas: Dado que Strand-seq no requiere lecturas (o pares de lecturas) que atraviesen los límites (o puntos de ruptura) de las CNV o las clases de variantes estructurales con número de copias equilibrado, es menos susceptible a los artefactos comunes de los métodos de célula única basados ​​en la amplificación del genoma completo, que incluyen pérdidas en la detección de variantes debido a la falta de lecturas en el punto de ruptura de la variante y quimeras de lectura. [ 7 ] [ 18 ] Strand-seq descubre todo el espectro de clases de variación estructural de al menos 200 kb de tamaño, incluidos los ciclos de ruptura-fusión-puente y los eventos de cromotripsis , así como las inversiones equilibradas y las translocaciones con número de copias equilibrado o desequilibrado. [ 18 ] " Las llamadas de variantes estructurales realizadas por Strand-seq se resuelven por haplotipo de longitud cromosómica , lo que proporciona una especificidad adicional en la llamada de variantes. [ 18 ] Como limitación actual, Strand-seq requiere células en división para el etiquetado específico de la hebra utilizando bromodesoxiuridina (BrdU), y el método no detecta variantes de tamaño inferior a 200 kb, como las inserciones de elementos móviles .

Aplicaciones

Los microbiomas se encuentran entre los principales objetivos de la genómica unicelular debido a la dificultad de cultivar la mayoría de los microorganismos en la mayoría de los entornos. La genómica unicelular es una forma poderosa de obtener secuencias del genoma microbiano sin cultivo. Este enfoque se ha aplicado ampliamente a microbiomas marinos, de suelo, subsuperficiales, de organismos y de otros tipos para abordar una amplia gama de preguntas relacionadas con la ecología microbiana , la evolución, la salud pública y el potencial biotecnológico. [ 20 ] [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]

La secuenciación del cáncer es también una aplicación emergente de scDNAseq. Los tumores frescos o congelados pueden analizarse y categorizarse con respecto a SCNA, SNV y reordenamientos bastante bien utilizando enfoques de secuenciación del ADN del genoma completo. [ 29 ] El scDNAseq del cáncer es particularmente útil para examinar la profundidad de la complejidad y las mutaciones compuestas presentes en objetivos terapéuticos amplificados como los genes de la tirosina quinasa del receptor (EGFR, PDGFRA, etc.) donde los enfoques convencionales a nivel de población del tumor en su conjunto no pueden resolver los patrones de coocurrencia de estas mutaciones dentro de las células individuales del tumor. Dicha superposición puede proporcionar redundancia de la activación de la vía y resistencia de las células tumorales.

secuenciación del metiloma del ADN

Un método para la secuenciación de la metilación del ADN de células individuales. [ 30 ]

La secuenciación del metiloma del ADN de células individuales cuantifica la metilación del ADN . Existen varios tipos conocidos de metilación que ocurren en la naturaleza, incluyendo 5-metilcitosina (5mC), 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 6-metiladenosina (6mA) y 4-metilcitosina (4mC). En eucariotas, especialmente en animales, la 5mC está ampliamente distribuida a lo largo del genoma y desempeña un papel importante en la regulación de la expresión génica al reprimir los elementos transponibles . [ 31 ] La secuenciación de 5mC en células individuales puede revelar cómo los cambios epigenéticos en células genéticamente idénticas de un solo tejido o población dan lugar a células con diferentes fenotipos.

Métodos

La secuenciación con bisulfito se ha convertido en el estándar de oro para la detección y secuenciación de 5mC en células individuales. [ 32 ] El tratamiento del ADN con bisulfito convierte los residuos de citosina en uracilo, pero deja intactos los residuos de 5-metilcitosina. Por lo tanto, el ADN tratado con bisulfito conserva solo las citosinas metiladas. Para obtener la lectura del metiloma, la secuencia tratada con bisulfito se alinea con un genoma no modificado. La secuenciación de bisulfito del genoma completo se logró en células individuales en 2014. [ 33 ] El método supera la pérdida de ADN asociada con el procedimiento típico, donde se agregan adaptadores de secuenciación antes de la fragmentación con bisulfito. En cambio, los adaptadores se agregan después de que el ADN se trata y fragmenta con bisulfito, lo que permite que todos los fragmentos se amplifiquen mediante PCR. [ 34 ] Mediante secuenciación profunda, este método captura aproximadamente el 40 % del total de CpG en cada célula. Con la tecnología actual, el ADN no se puede amplificar antes del tratamiento con bisulfito, ya que las marcas de 5mC no serán copiadas por la polimerasa.

La secuenciación de bisulfito de representación reducida de células individuales (scRRBS) es otro método. [ 35 ] Este método aprovecha la tendencia de las citosinas metiladas a agruparse en islas CpG (CGI) para enriquecer áreas del genoma con un alto contenido de CpG. Esto reduce el costo de la secuenciación en comparación con la secuenciación de bisulfito del genoma completo, pero limita la cobertura de este método. Cuando se aplica RRBS a muestras masivas, se detecta la mayoría de los sitios CpG en los promotores de genes, pero los sitios en los promotores de genes solo representan el 10% de los sitios CpG en todo el genoma. [ 36 ] En células individuales, se detecta el 40% de los sitios CpG de la muestra masiva. Para aumentar la cobertura, este método también se puede aplicar a un pequeño grupo de células individuales. En una muestra de 20 células individuales agrupadas, se detectó el 63% de los sitios CpG de la muestra masiva. La agrupación de células individuales es una estrategia para aumentar la cobertura del metiloma, pero a costa de ocultar la heterogeneidad en la población de células.

Limitaciones

Aunque la secuenciación con bisulfito sigue siendo el método más utilizado para la detección de 5mC, el tratamiento químico es agresivo y fragmenta y degrada el ADN. Este efecto se agrava al pasar de muestras masivas a células individuales. Otros métodos para detectar la metilación del ADN incluyen enzimas de restricción sensibles a la metilación. Estas enzimas también permiten la detección de otros tipos de metilación, como 6mA con DpnI . [ 37 ] La ​​secuenciación basada en nanoporos también ofrece una vía para la secuenciación directa de la metilación sin fragmentación ni modificación del ADN original. La secuenciación de nanoporos se ha utilizado para secuenciar los metilomas de bacterias, que están dominados por 6mA y 4mC (a diferencia de 5mC en eucariotas), pero esta técnica aún no se ha escalado a células individuales. [ 38 ]

Aplicaciones

La secuenciación de metilación de ADN de células individuales se ha utilizado ampliamente para explorar las diferencias epigenéticas en células genéticamente similares. Para validar estos métodos durante su desarrollo, los datos del metiloma de células individuales de una población mixta se clasificaron con éxito mediante agrupamiento jerárquico para identificar distintos tipos de células. [ 35 ] Otra aplicación es el estudio de células individuales durante las primeras divisiones celulares en el desarrollo temprano para comprender cómo emergen diferentes tipos de células de un solo embrión. [ 39 ] La secuenciación de bisulfito del genoma completo de células individuales también se ha utilizado para estudiar tipos de células raras pero altamente activas en el cáncer, como las células tumorales circulantes (CTC). [ 40 ]

Comparación de métodos de secuenciación de metilación de células individuales en términos de cobertura a fecha de 2015 en Mus musculus

Secuenciación de cromatina accesible a la transposasa (scATAC-seq)

La secuenciación de cromatina accesible mediante transposasa de células individuales mapea la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma. Una transposasa inserta adaptadores de secuenciación directamente en regiones abiertas de la cromatina, lo que permite que esas regiones se amplifiquen y secuencien. [ 41 ]

Métodos

Los dos métodos para la preparación de bibliotecas en scATAC-Seq se basan en la indexación celular por división y agrupación, y en la microfluídica.

Secuenciación del transcriptoma (scRNA-seq)

Los métodos estándar, como los microarrays y la secuenciación masiva de ARN (RNA-seq), analizan la expresión de ARN de grandes poblaciones celulares. Estas mediciones pueden ocultar diferencias cruciales entre células individuales en poblaciones celulares mixtas. [ 42 ] [ 43 ]

La secuenciación de ARN de célula única (scRNA-seq) proporciona los perfiles de expresión de células individuales y se considera el método de referencia para definir estados y fenotipos celulares desde 2020. [ 44 ] Aunque es imposible obtener información completa sobre cada ARN expresado por cada célula, debido a la pequeña cantidad de material disponible, los patrones de expresión génica pueden identificarse mediante análisis de agrupamiento de genes . [ 45 ] Esto puede descubrir tipos celulares raros dentro de una población celular que quizás nunca se hayan visto antes. Por ejemplo, un grupo de científicos que realizó scRNA-seq en tejido tumoral de neuroblastoma identificó una célula cancerosa pan-neuroblastoma rara, que puede ser atractiva para nuevos enfoques terapéuticos. [ 46 ]

Métodos

Flujo de trabajo de secuenciación de ARN de células individuales

Los protocolos actuales de scRNA-seq implican aislar células individuales y su ARN, y luego seguir los mismos pasos que en la secuenciación de ARN en masa: transcripción inversa (RT), amplificación, generación de bibliotecas y secuenciación. Los primeros métodos separaban las células individuales en pocillos separados; los métodos más recientes encapsulan células individuales en gotas en un dispositivo microfluídico, donde tiene lugar la reacción de transcripción inversa, que convierte los ARN en ADNc. Cada gota contiene un "código de barras" de ADN que etiqueta de forma única los ADNc derivados de una sola célula. Una vez completada la transcripción inversa, los ADNc de muchas células se pueden mezclar para su secuenciación, ya que los transcritos de una célula en particular se identifican mediante el código de barras único. [ 47 ] [ 48 ]

Challenges for scRNA-Seq include preserving the initial relative abundance of mRNA in a cell and identifying rare transcripts.[49] The reverse transcription step is critical as the efficiency of the RT reaction determines how much of the cell's RNA population will be eventually analyzed by the sequencer. The processivity of reverse transcriptases and the priming strategies used may affect full-length cDNA production and the generation of libraries biased toward 3' or 5' end of genes.

In the amplification step, either PCR or in vitro transcription (IVT) is currently used to amplify cDNA. One of the advantages of PCR-based methods is the ability to generate full-length cDNA. However, different PCR efficiency on particular sequences (for instance, GC content and snapback structure) may also be exponentially amplified, producing libraries with uneven coverage. On the other hand, while libraries generated by IVT can avoid PCR-induced sequence bias, specific sequences may be transcribed inefficiently, thus causing sequence drop-out or generating incomplete sequences.[1][42] Several scRNA-seq protocols have been published: Tang et al.,[50] STRT,[51] SMART-seq,[52] SORT-seq,[53] CEL-seq,[54] RAGE-seq,[55] Quartz-seq.[56] , and C1-CAGE.[57] These protocols differ in terms of strategies for reverse transcription, cDNA synthesis and amplification, and the possibility to accommodate sequence-specific barcodes (i.e., UMIs) or the ability to process pooled samples.[58]

In 2017, two approaches were introduced to simultaneously measure single-cell mRNA and protein expression through oligonucleotide-labeled antibodies known as REAP-seq,[59] and CITE-seq.[60] Collecting cellular contents following electrophysiological recording using patch-clamp has also allowed development of the Patch-Seq method, which is steadily gaining ground in neuroscience.[61]

Example of a droplet based platform - 10X method

Esta plataforma de secuenciación de ARN de células individuales permite analizar transcriptomas célula por célula mediante el uso de partición microfluídica para capturar células individuales y preparar bibliotecas de ADNc para secuenciación de próxima generación (NGS) . [ 62 ] La plataforma basada en gotas permite la secuenciación masivamente paralela de ARNm en un gran número de células individuales mediante la captura de células individuales en gotas de aceite. [ 63 ]

En general, en una primera etapa, las células individuales se capturan por separado y se lisan; luego se realiza la transcripción inversa (RT) del ARNm y se obtiene una biblioteca de ADNc . Para seleccionar el ARNm, la RT se realiza con una secuencia monocatenaria de un cebador de desoxitimina (oligo dT) que se une específicamente a la cola de poli(A) de las moléculas de ARNm. Posteriormente, la biblioteca de ADNc amplificada se utiliza para la secuenciación. [ 64 ]

Así pues, el primer paso del método es la encapsulación de células individuales y la preparación de la biblioteca. Las células se encapsulan en Gel Beads-in-emulsion (GEM) gracias a un sistema automatizado. Para formar estas vesículas, el sistema automatizado utiliza un chip microfluídico y combina todos los componentes con aceite. Cada GEM funcional contiene una sola célula, una sola Gel Bead y reactivos de RT. En la Gel Bead se unen oligonucleótidos compuestos por 4 partes distintas: cebador de PCR (esencial para la secuenciación); oligonucleótidos con código de barras 10X; secuencia de identificador molecular único (UMI); secuencia de PolydT (que permite la captura de moléculas de ARNm poliadenilado ). [ 65 ] Dentro de cada vesícula de reacción GEM, una sola célula se lisa y se somete a transcripción inversa. El ADNc de la misma célula se identifica gracias a un código de barras 10X común. Además, el número de UMI expresa el nivel de expresión génica y su análisis permite detectar genes altamente variables. Estos datos se utilizan a menudo para la clasificación del fenotipo celular o para la identificación de nuevas subpoblaciones. [ 66 ]

El paso final de la plataforma es la secuenciación. Las bibliotecas generadas pueden utilizarse directamente para la secuenciación del transcriptoma completo de células individuales o para flujos de trabajo de secuenciación dirigida. La secuenciación se realiza mediante el método de secuenciación por tinción de Illumina . Este método se basa en el principio de secuenciación por síntesis (SBS) y en el uso de terminadores de tinte reversibles que permiten la identificación de cada nucleótido individual. Para leer las secuencias de transcripción en un extremo y el código de barras y el UMI en el otro, se requieren lectores de secuenciación de extremos apareados. [ 67 ]

The droplet-based platform allows the detection of rare cell types thanks to its high throughput. In fact, 500 to 20,000 cells are captured per sample from a single cell suspension. The protocol is performed easily and allows a high cell recovery rate of up to 65%. The global workflow of the droplet-based platform takes 8 hours and so is faster than the Microwell-based method (BD Rhapsody), which takes 10 hours. However, it presents some limitations as the need of fresh samples and the final detection of only 10% mRNA.

The major difference between the droplet-based method and the microwell-based method is the technique used for partitioning cells.[64]

Limitations

Most RNA-seq methods depend on poly(A) tail capture to enrich mRNA and deplete abundant and uninformative rRNA. Thus, they are often restricted to sequencing polyadenylated mRNA molecules. However, recent studies are now starting to appreciate the importance of non-poly(A) RNA, such as long-noncoding RNA and microRNAs in gene expression regulation. Small-seq is a single-cell method that captures small RNAs (<300 nucleotides) such as microRNAs, fragments of tRNAs and small nucleolar RNAs in mammalian cells.[68] This method uses a combination of "oligonucleotide masks" (that inhibit the capture of highly abundant 5.8S rRNA molecules) and size selection to exclude large RNA species such as other highly abundant rRNA molecules. To target larger non-poly(A) RNAs, such as long non-coding mRNA, histone mRNA, circular RNA, and enhancer RNA, size selection is not applicable for depleting the highly abundant ribosomal RNA molecules (18S and 28s rRNA).[69] Single-cell RamDA-Seq is a method that achieves this by performing reverse transcription with random priming (random displacement amplification) in the presence of "not so random" (NSR) primers specifically designed to avoid priming on rRNA molecule.[70] While this method successfully captures full-length total RNA transcripts for sequencing and detected a variety of non-poly(A) RNAs with high sensitivity, it has some limitations. The NSR primers were carefully designed according to rRNA sequences in the specific organism (mouse), and designing new primer sets for other species would take considerable effort. Recently, a CRISPR-based method named scDASH (single-cell depletion of abundant sequences by hybridization) demonstrated another approach to depleting rRNA sequences from single-cell total RNA-seq libraries.[71]

Actualmente, las bacterias y otros procariotas no son aptos para la secuenciación de ARN de célula única debido a la falta de ARNm poliadenilado. Por lo tanto, el desarrollo de métodos de secuenciación de ARN de célula única que no dependan de la captura de la cola de poli(A) también será fundamental para permitir estudios de microbioma con resolución de célula única. Los estudios bacterianos masivos suelen aplicar el agotamiento general del ARNr para superar la falta de ARNm poliadenilado en las bacterias, pero a nivel de célula única, el ARN total que se encuentra en una célula es demasiado pequeño. [ 69 ] La falta de ARNm poliadenilado y la escasez de ARN total que se encuentra en células bacterianas individuales son dos barreras importantes que limitan la aplicación de la secuenciación de ARN de célula única en bacterias.

También surgen limitaciones debido al muestreo parcial y sesgado de scRNA-seq, ya que esta técnica solo captura una instantánea de la actividad celular. Por ejemplo, en tipos celulares grandes y ramificados como las neuronas , el aislamiento de células individuales solo captura el ARN de los cuerpos celulares centrales separados de sus prolongaciones durante la trituración. En el cerebro, se estima que más del 40 % del ARN total se encuentra en prolongaciones celulares como axones , dendritas y pies terminales de astrocitos , y por lo tanto no es visible para los métodos de scRNA-seq. [ 72 ]

Aplicaciones

La secuenciación de ARN de célula única (scRNA-Seq) se está utilizando ampliamente en diversas disciplinas biológicas, incluyendo biología del desarrollo , [ 73 ] neurología , [ 74 ] oncología , [ 75 ] [ 76 ] [ 77 ] inmunología , [ 78 ] [ 79 ] [ 80 ] investigación cardiovascular, [ 81 ] [ 82 ] enfermedades cerebrales , [ 83 ] y enfermedades infecciosas . [ 84 ] [ 85 ]

Mediante métodos de aprendizaje automático , se han utilizado datos de RNA-Seq masivo para aumentar la relación señal/ruido en scRNA-Seq. Específicamente, los científicos han utilizado perfiles de expresión génica de conjuntos de datos pancáncer para construir redes de coexpresión y luego las han aplicado a perfiles de expresión génica de células individuales, obteniendo un método más robusto para detectar la presencia de mutaciones en células individuales utilizando niveles de transcripción. [ 86 ]

Algunos métodos de scRNA-seq también se han aplicado a microorganismos de células individuales. SMART-seq2 se ha utilizado para analizar microbios eucariotas de células individuales, pero dado que depende de la captura de la cola de poli(A), no se ha aplicado en células procariotas. [ 87 ] Se han utilizado enfoques microfluídicos como Drop-seq y los dispositivos Fluidigm IFC-C1 para secuenciar parásitos de malaria individuales o células de levadura individuales. [ 88 ] [ 89 ] El estudio de levadura de células individuales buscó caracterizar la tolerancia heterogénea al estrés en células de levadura isogénicas antes y después de que la levadura se exponga al estrés salino. El análisis de células individuales de varios factores de transcripción por scRNA-seq reveló heterogeneidad en toda la población. Estos resultados sugieren que la regulación varía entre los miembros de una población para aumentar las posibilidades de supervivencia para una fracción de la población.

El primer análisis de transcriptoma de célula única en una especie procariota se realizó utilizando la enzima exonucleasa terminadora para degradar selectivamente el ARNr y la amplificación por círculo rodante (RCA) del ARNm. [ 90 ] En este método, los extremos del ADN monocatenario se ligaron para formar un círculo, y el bucle resultante se utilizó como plantilla para la amplificación lineal del ARN. La biblioteca de productos final se analizó mediante microarrays, con bajo sesgo y buena cobertura. Sin embargo, la RCA no se ha probado con RNA-seq, que normalmente emplea secuenciación de nueva generación. El RNA-seq de célula única para bacterias sería muy útil para estudiar los microbiomas. Abordaría los problemas encontrados en los enfoques convencionales de metatranscriptómica masiva, como la imposibilidad de capturar especies presentes en baja abundancia y la imposibilidad de resolver la heterogeneidad entre poblaciones celulares.

La secuenciación de ARN de célula única (scRNA-Seq) ha proporcionado información considerable sobre el desarrollo de embriones y organismos, incluyendo el gusano Caenorhabditis elegans [ 91 ] , la planaria regenerativa Schmidtea mediterranea [ 92 ] [ 93 ] y el ajolote Ambystoma mexicanum [ 94 ] [ 95 ] . Los primeros vertebrados que se mapearon de esta manera fueron el pez cebra [ 96 ] [ 97 ] [ 98 ] y Xenopus laevis [ 99 ] . En cada caso, se estudiaron múltiples etapas del embrión, lo que permitió mapear todo el proceso de desarrollo célula por célula. La ciencia reconoció estos avances como el Avance Científico del Año 2018 [ 100 ] .

Se estableció un atlas celular molecular de testículos de ratones para definir la toxicidad testicular prepuberal inducida por BDE47 utilizando el enfoque ScRNA-seq, lo que proporciona información novedosa sobre nuestra comprensión de los mecanismos y vías subyacentes involucrados en la lesión testicular asociada a BDE47 con resolución de célula única. [ 101 ]

Consideraciones

Aislamiento de células individuales

Hay varias formas de aislar células individuales antes de la amplificación y secuenciación del genoma completo. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es un enfoque ampliamente utilizado. Las células individuales también se pueden recolectar mediante micromanipulación, por ejemplo, mediante dilución en serie o utilizando una micropipeta o nanotubo para recolectar una sola célula. [ 15 ] [ 102 ] Las ventajas de la micromanipulación son la facilidad y el bajo costo, pero son laboriosas y susceptibles a la identificación errónea de tipos de células bajo el microscopio. La microdisección por captura láser (LCM) también se puede utilizar para recolectar células individuales. Aunque la LCM conserva el conocimiento de la ubicación espacial de una célula muestreada dentro de un tejido, es difícil capturar una sola célula completa sin recolectar también el material de las células vecinas. [ 42 ] [ 103 ] [ 104 ] Los métodos de alto rendimiento para el aislamiento de células individuales también incluyen la microfluídica . Tanto FACS como la microfluídica son precisos, automáticos y capaces de aislar muestras no sesgadas. Sin embargo, ambos métodos requieren separar primero las células de sus microambientes, lo que provoca perturbaciones en los perfiles transcripcionales en el análisis de la expresión de ARN. [ 105 ] [ 106 ]

Número de células que se van a secuenciar y analizar.

Secuenciación de ARN de célula única

Los protocolos de secuenciación de ARN de célula única varían en la eficiencia de captura de ARN, lo que resulta en diferencias en el número de transcritos generados por cada célula. Las bibliotecas de células únicas se suelen secuenciar hasta una profundidad de 1.000.000 de lecturas, ya que la gran mayoría de los genes se detectan con 500.000 lecturas. [ 107 ] Aumentar el número de células y disminuir la profundidad de lectura incrementa la capacidad de identificar poblaciones celulares principales. Sin embargo, las bajas profundidades de lectura no siempre proporcionan la información necesaria sobre los genes, y la diferencia en su expresión entre las poblaciones celulares depende de la estabilidad y detección de las moléculas de ARNm.

Las covariables de control de calidad sirven como estrategia para analizar el número de células. Estas covariables incluyen principalmente el filtrado basado en la profundidad de recuento, el número de genes y la fracción de recuentos de genes mitocondriales, lo que permite interpretar las señales celulares.

Véase también

Referencias

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