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Tcr-seq

TCR-Seq ( secuenciación del receptor de células T ) es un método utilizado para identificar y rastrear células T específicas y sus clones. [ 1 ] TCR-Seq utiliza la naturaleza ún...

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TCR-Seq ( secuenciación del receptor de células T ) es un método utilizado para identificar y rastrear células T específicas y sus clones. [ 1 ] TCR-Seq utiliza la naturaleza única de un receptor de células T (TCR) como un código de barras molecular prefabricado. [ 1 ] Esta tecnología se puede aplicar tanto a tecnologías de secuenciación de células individuales como a cribados de alto rendimiento. [ 1 ]

Fondo

Receptor de células T (TCR)

Las células T forman parte del sistema inmunitario adaptativo y desempeñan un papel fundamental en la protección del organismo contra patógenos extraños . [ 2 ] Los receptores de células T (TCR) son un grupo de proteínas de membrana que se encuentran en la superficie de las células T y que pueden unirse a antígenos extraños. [ 3 ] Los TCR interactúan con los complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) en la superficie celular para reconocer antígenos . Son heterodímeros formados predominantemente por cadenas α y β (o, más raramente, cadenas δ y γ) [ 4 ] y constan de una región variable y una región constante. Las regiones variables se producen mediante un proceso llamado recombinación VDJ , que da como resultado secuencias de aminoácidos únicas para las cadenas α, β y γ. Como resultado, cada TCR es único y reconoce un antígeno específico. [ 4 ]

Regiones determinantes de la complementariedad (CDR)

Representación visual de las Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) en forma lineal y en forma de receptor.

Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) forman parte del TCR y desempeñan un papel esencial en las interacciones TCR-MHC. CDR1 y CDR2 están codificadas por genes V, mientras que CDR3 se forma a partir de la región entre los genes V y J o entre los genes D y J (denominadas " genes VDJ " cuando se mencionan conjuntamente). [ 4 ] CDR3 es la más variable de las CDR y está en contacto directo con el antígeno. [ 4 ] [ 5 ] Por ello, CDR3 se utiliza como "región de código de barras" para identificar poblaciones únicas de células T, ya que es muy improbable que dos células T tengan la misma secuencia de CDR3 a menos que provengan de la misma célula T parental. [ 4 ] [ 5 ]

Clonalidad

Expansión clonal de las células T al encontrarse con un antígeno extraño presentado por otra célula.

La recombinación VDJ produce una cantidad tan vasta de TCR únicos que muchos receptores nunca encuentran el antígeno para el que están mejor preparados. Cuando un antígeno extraño está presente en el cuerpo, las pocas células T que reconocen ese antígeno son seleccionadas positivamente para que el cuerpo tenga un número adecuado de células T para generar una respuesta inmune efectiva. [ 6 ] Las células T seleccionadas se dividen y diferencian rápidamente en células T efectoras a través de un proceso llamado expansión clonal, [ 7 ] que conserva la secuencia TCR (incluida la secuencia CDR3) que originalmente reconoció el antígeno [ 8 ]

TCR-Seq utiliza la naturaleza única del TCR, en particular el CDR3, como un código de barras molecular para rastrear las células T a través de una variedad de procesos como la diferenciación y la proliferación, [ 9 ] que se puede utilizar para una amplia variedad de propósitos.

Métodos

Secuenciación masiva frente a secuenciación de células individuales

La secuenciación de TCR se puede realizar en poblaciones celulares agrupadas ("secuenciación masiva") o en células individuales (" secuenciación de células individuales "). [ 4 ] La secuenciación masiva es útil para explorar repertorios completos de TCR (todos los TCR dentro de un individuo o una muestra) y para generar comparaciones entre repertorios de diferentes individuos. [ 4 ] Este método puede secuenciar millones de células en un solo experimento. [ 5 ] Sin embargo, una desventaja importante es que la secuenciación masiva no puede determinar qué cadenas de TCR se emparejan, solo la frecuencia dentro del repertorio. La gran cantidad de TCR muestreados también significa que los TCR de menor abundancia pueden no ser detectados. [ 5 ] La secuenciación de células individuales puede determinar pares de cadenas de TCR, lo que las hace más útiles para identificar TCR específicos. [ 4 ] [ 5 ] Algunas desventajas importantes de esta técnica son sus altos costos, [ 4 ] capacidad limitada de unos pocos miles de células, [ 5 ] y la necesidad de células vivas que pueden ser más difíciles de obtener. [ 4 ]

Secuencias objetivo

Cualquier cadena TCR puede ser secuenciada, aunque las cadenas α y β son las más elegidas debido a su abundancia en la población de células T. [ 4 ] En particular, la cadena β es de interés debido a su mayor diversidad y especificidad en comparación con otras cadenas. La presencia de un componente del gen D en la cadena β, que no está presente en la cadena α, permite combinaciones más diversas. [ 4 ] [ 10 ] Además, las cadenas β son únicas para cada célula T, lo que puede utilizarse para identificar poblaciones de células T distintas dentro de una muestra. [ 4 ] [ 5 ] [ 10 ]

Para realizar la secuenciación del TCR, se lleva a cabo una amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la región CDR3 como medida de células T únicas dentro de una población. [ 4 ] [ 10 ] Se elige la región CDR3 en lugar de CDR1 y CDR2 porque es directamente responsable de las interacciones con el antígeno [ 4 ] [ 10 ] y generalmente es única para los TCR del mismo linaje, lo que permite la identificación de poblaciones distintas [ 10 ]

Preparación de la biblioteca

Un ejemplo de flujo de trabajo sobre cómo se realiza la secuenciación de TCR.

El objetivo de este paso es generar una biblioteca de transcripciones para su secuenciación. Existen tres métodos principales para generar una biblioteca para la secuenciación de TCR.

ADN multiplex

La PCR múltiple se puede emplear tanto en ADN genómico (ADNg) como en ARN que se ha convertido en ADN complementario de doble cadena (ADNc) . [ 4 ] Se utilizan grupos de cebadores con pares de cebadores dirigidos a los alelos J y V para amplificar la región CDR3 del transcrito del TCR. [ 4 ] [ 10 ] El transcrito pasa por dos o más rondas de PCR para amplificar la región de interés , luego se ligan adaptadores a cada extremo del transcrito resultante. [ 10 ] Este método es uno de los más utilizados en la generación de bibliotecas para TCR-seq ya que puede capturar una gran parte de la diversidad del TCR a través del grupo de cebadores. [ 4 ] [ 10 ] Sin embargo, como es casi imposible optimizar las condiciones de PCR para todos los cebadores en el grupo, el ADN múltiple puede dar lugar a un sesgo de amplificación donde algunas regiones CDR3 con cebadores que se unen débilmente pueden no ser amplificadas. [ 5 ] [ 10 ] Esto significa que la abundancia de segmentos amplificados puede no corresponderse con la abundancia real dentro de la célula [ 5 ] [ 10 ]

Enriquecimiento de objetivos en solución

Este método puede utilizar gDNA genómico o ARN convertido a cDNA. [ 4 ] [ 10 ] El material de partida se procesa primero para generar transcripciones de ADN o cDNA con adaptadores indexados en los extremos 5' y 3'. [ 4 ] Estas transcripciones se incuban luego con cebos de ARN diseñados para unirse a regiones de interés, que generalmente es la región CDR3. [ 4 ] Estos cebos, que normalmente están unidos a perlas magnéticas, pueden aislarse usando un imán. Esto permite el aislamiento de transcripciones de la región CDR3 que luego pueden amplificarse usando PCR. [ 4 ] El enriquecimiento del objetivo usando cebos de ARN requiere menos pasos de amplificación por PCR, lo que puede disminuir el sesgo de amplificación. [ 4 ] Sin embargo, la eficiencia de la captura por imanes puede afectar la diversidad de las transcripciones amplificadas.

5'-CARRERA

La amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) es un método que utiliza transcripciones de ARN para la generación de la biblioteca. [ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] Aunque RACE puede aplicarse con el extremo 3' o el extremo 5', el extremo 5' se usa más comúnmente para TCR-seq. [ 4 ] Este método gira en torno a la adición de una secuencia adaptadora 5' común al transcrito, lo que puede hacerse de varias maneras diferentes. [ 11 ] [ 12 ] Un método es agregar el adaptador después de la transcripción inversa . Durante la generación de la cadena de ADN inversa a partir de la plantilla de ARN, un cebador directo agrega una secuencia complementaria al adaptador 5', lo que lleva al cambio de plantilla [ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] Esto permite que un adaptador 5' se incorpore al ADNc cuando se genera la secuencia complementaria. [ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] Se pueden diseñar cebadores para amplificar toda la región desde el adaptador hasta la región constante, [ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] luego se puede realizar la ligación del adaptador en una segunda reacción de PCR. Como todos los diferentes transcritos ahora comparten un adaptador idéntico, se pueden amplificar usando un solo par de cebadores. De esta manera, este método disminuye el sesgo de amplificación y mejora la capacidad de detectar poblaciones de TCR menos comunes con mayor certeza. [ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] Sin embargo, como los niveles de transcripción de TCR difieren entre células, este método no puede proporcionar una medición precisa del número de diferentes tipos de células T en la muestra basándose únicamente en el nivel de transcritos de ARN [ 4 ]

Secuenciación

Tras la generación de la biblioteca, los productos pueden secuenciarse, generalmente mediante secuenciación de nueva generación (NGS) . [ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] Es importante el uso de máquinas capaces de realizar lecturas más largas y mantener la calidad de lectura en el extremo 3', ya que la región CDR3 se encuentra en el extremo 3' de un transcrito de aproximadamente 500 pares de bases. [ 10 ]

La tasa de error de NGS presenta un desafío para el análisis de repertorios de TCR. [ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] Pequeñas variaciones en el TCR pueden cambiar su especificidad hacia los antígenos, [ 10 ] y como tales pueden ser de interés para los investigadores. Sin embargo, los errores en la secuenciación pueden generar un cambio menor que puede interpretarse como una población de TCR distinta y de baja frecuencia, [ 10 ] lo cual es un problema al analizar cambios en los repertorios de TCR. Se han hecho esfuerzos para establecer umbrales para eliminar lecturas de baja abundancia del análisis, así como para desarrollar algoritmos para corregir estos errores [ 10 ]

Aplicaciones

Generalmente, los datos recopilados de TCR-seq se utilizan para comparar repertorios de TCR, ya sea entre el mismo paciente en diferentes momentos o entre diferentes pacientes. [ 4 ] [ 10 ] [ 11 ] Estudios recientes examinaron las características de un repertorio sano y encontraron un alto grado de variación en los niveles y tipos de cadenas β de TCR, aunque un subconjunto es compartido entre diferentes individuos. [ 10 ] Sin embargo, aún no se ha demostrado que esta diversidad se correlacione fuertemente con ninguna condición de interés, como tasas de infección o probabilidad de recaída del cáncer, [ 10 ] lo que sugiere que es necesaria más investigación.

Enfermedades infecciosas

La expansión clonal de las células T permite al sistema inmunitario hacer frente a diversas enfermedades infecciosas con alta especificidad. [ 13 ] Por lo tanto, comprender los cambios que se producen en el repertorio de células T tras una infección puede facilitar el diagnóstico precoz, el seguimiento de la enfermedad y el desarrollo de terapias. [ 5 ]

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una enfermedad devastadora causada por la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , que provoca la muerte de las células T CD4+ [ 14 ] y la disfunción de las células T CD8+ [ 5 ] . Estudios recientes han sugerido que una mayor diversidad del TCR puede disminuir la diversidad del VIH y limitar la progresión de la enfermedad [5, 15 ] . La secuenciación del TCR también aumentaría la comprensión de la progresión del SIDA y permitiría predecir la morbilidad [ 5 ] . Además, la secuenciación del repertorio de TCR de individuos con defensa natural contra la infección por SIDA [ 16 ] podría ayudar al desarrollo de una vacuna para limitar la propagación de la enfermedad [ 5 ].

Cáncer

El cáncer es la proliferación incontrolada de células malignas que pueden diseminarse por todo el cuerpo. [ 17 ] Esto es causado por mutaciones dentro de la célula cancerosa, que a menudo conducen a la expresión de proteínas mutantes denominadas neoantígenos . [ 5 ] [ 17 ] La identificación de estos neoantígenos tiene un gran beneficio terapéutico, ya que pueden ser explotados para atacar las células cancerosas sin dañar las células normales. Como las células T CD8+ pueden reconocer algunos neoantígenos en su TCR, la secuenciación de los repertorios de TCR puede ayudar a identificar posibles biomarcadores de cáncer . [ 5 ] Además de la identificación de biomarcadores, la secuenciación del repertorio de TCR también puede rastrear cambios en la progresión del cáncer, evaluar respuestas a la inmunoterapia , [ 18 ] y evaluar el microambiente tumoral.t para condiciones que pueden hacer permisible el crecimiento del cáncer [ 5 ]

Véase también

Referencias

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