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Articulo de referencia

Secuenciación de bisulfito de representación reducida

La secuenciación de bisulfito de representación reducida ( RRBS ) es una técnica eficiente y de alto rendimiento para analizar los perfiles de metilación del genoma a nivel de n...

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La secuenciación de bisulfito de representación reducida ( RRBS ) es una técnica eficiente y de alto rendimiento para analizar los perfiles de metilación del genoma a nivel de nucleótido único. Combina enzimas de restricción y secuenciación de bisulfito para enriquecer las áreas del genoma con un alto contenido de CpG . Debido al alto costo y profundidad de la secuenciación para analizar el estado de metilación en todo el genoma, Meissner et al. desarrollaron esta técnica en 2005 para reducir la cantidad de nucleótidos necesarios para la secuenciación al 1 % del genoma. [ 1 ] Los fragmentos que componen el genoma reducido aún incluyen la mayoría de los promotores , así como regiones como secuencias repetidas que son difíciles de perfilar utilizando enfoques de secuenciación de bisulfito convencionales. [ 2 ]

Esquema del protocolo para la secuenciación con bisulfito de representación reducida.

Descripción general del protocolo

  1. Digestión enzimática : Primero, el ADN genómico se digiere con una enzima de restricción insensible a la metilación, como MspI. Es fundamental que la enzima no se vea afectada por el estado de metilación de los CpG , ya que esto permite la digestión tanto de regiones metiladas como no metiladas. Esta enzima actúa sobre 5’CCGG3’secuencias específicas y escinde los enlaces fosfodiéster situados antes del dinucleótido CpG. Al utilizar esta enzima en particular, cada fragmento presenta un CpG en cada extremo. Esta digestión genera fragmentos de ADN de diversos tamaños.
  2. Reparación de extremos y adición de cola de adenina : Debido a la forma en que la enzima MspI corta el ADN de doble cadena, esta reacción produce cadenas con extremos cohesivos . La reparación de extremos es necesaria para rellenar el extremo 3' de las cadenas. El siguiente paso consiste en añadir una adenosina adicional a ambas cadenas, positiva y negativa . Esto se conoce como adición de cola de adenina y es necesario para la ligación del adaptador en el paso posterior. La reparación de extremos y la adición de cola de adenina se realizan en las mismas reacciones, con los desoxirribonucleótidos dCTP, dGTP y dATP. Para aumentar la eficiencia de la adición de cola de adenina, los dATP se añaden en exceso en esta reacción.
  3. Adaptadores de secuencia : Los adaptadores de secuencia metilados se ligan a los fragmentos de ADN. Los oligonucleótidos adaptadores metilados tienen todas las citosinas reemplazadas por 5'-metilcitosinas para evitar la desaminación de estas citosinas en la reacción de conversión con bisulfito. Para secuenciar las reacciones con secuenciadores Illumina, los adaptadores de secuencia se hibridan con los adaptadores de la celda de flujo.
  4. Purificación de fragmentos : Se selecciona el tamaño deseado de fragmentos para su purificación. Los fragmentos de diferentes tamaños se separan mediante electroforesis en gel y se purifican mediante escisión del gel. Según Gu et al., los fragmentos de ADN de 40 a 220 pares de bases son representativos de la mayoría de las secuencias promotoras e islas CpG [ 2 ].
  5. Conversión con bisulfito : Los fragmentos de ADN se someten a una conversión con bisulfito, un proceso que desamina la citosina no metilada transformándola en uracilo . Las citosinas metiladas permanecen inalteradas, ya que el grupo metilo las protege de la reacción.
  6. Amplificación por PCR : El ADN tratado con bisulfito se amplifica posteriormente mediante PCR utilizando cebadores complementarios a los adaptadores de secuencia.
  7. Purificación de PCR : Antes de la secuenciación, el producto de PCR debe estar libre de reactivos de reacción no utilizados, como dNTPs o sales no incorporadas, y requiere purificación. Esto se puede lograr mediante electroforesis en gel o utilizando kits diseñados específicamente para la purificación de PCR.
  8. Secuenciación : Los fragmentos se secuencian en función del rendimiento, la precisión y el tiempo de procesamiento deseados. Inicialmente se utilizaba la secuenciación de Sanger , pero actualmente se prefiere a las técnicas de secuenciación de nueva generación.
  9. Análisis bioinformático : Debido a las propiedades únicas de RRBS, se necesita software especial para el alineamiento y el análisis. [ 3 ] El uso de MspI para digerir el ADN genómico produce fragmentos que siempre comienzan con una C (si la citosina está metilada) o una T (si una citosina no fue metilada y se convirtió en uracilo en la reacción de conversión con bisulfito). Esto resulta en una composición de pares de bases no aleatoria. Además, la composición de bases está sesgada debido a las frecuencias sesgadas de C y T dentro de las muestras. Hay varios programas de software disponibles para el alineamiento y el análisis, como Maq, BS Seeker, Bismark o BSMAP. El alineamiento a un genoma de referencia permite a los programas identificar pares de bases dentro del genoma que están metilados.

Ventajas

Enriquecimiento de CpGs

RRBS utiliza de forma exclusiva una enzima de restricción específica para enriquecer los CpG. La digestión con MspI, o cualquier enzima de restricción que reconozca y corte los CpG, produce únicamente fragmentos con CG al final. [ 2 ] Este enfoque enriquece las regiones CpG del genoma, lo que puede disminuir la cantidad de secuenciación necesaria y reducir el costo. [ 2 ] Esta técnica es rentable, especialmente cuando se centra en regiones CpG comunes.

Protocolo de secuenciación con bisulfito de representación reducida

Entrada de muestra baja

 Solo se requiere una baja concentración de muestra, entre 10 y 300 ng, para un análisis de datos preciso. [ 2 ] Esta técnica puede emplearse cuando hay escasez de muestras valiosas. Otro aspecto positivo es que no se requieren muestras frescas o vivas. También se pueden utilizar muestras fijadas con formalina e incluidas en parafina. [ 2 ]

Limitaciones

Enzima de restricción

En los pasos específicos del protocolo, también existen algunas limitaciones. La digestión con MspI cubre la mayoría, pero no todas, las regiones CG del genoma. [ 2 ] Algunos CpG no se detectan. La omisión de CpG también puede ocurrir dado que este protocolo solo realiza un muestreo representativo del genoma. [ 2 ] Por lo tanto, algunas regiones tienen una cobertura menor. Otras variaciones de este protocolo utilizan enzimas alternativas. [ 4 ]

PCR

Durante la etapa de PCR del protocolo, debe utilizarse una polimerasa sin actividad correctora, ya que una enzima correctora se detendría en los residuos de uracilo presentes en la plantilla de ADN monocatenario. [ 1 ] El uso de una polimerasa sin actividad correctora también puede aumentar los errores de secuenciación por PCR. [ 1 ]

Secuenciación con bisulfito

La secuenciación con bisulfito solo convierte el ADN monocatenario (ssDNA). La conversión completa con bisulfito requiere una desnaturalización completa y la ausencia de ADN bicatenario (dsDNA) reasociado. [ 1 ] Se ha demostrado que pasos de protocolo sencillos conducen a la desnaturalización completa. Asegurar el uso de pequeños fragmentos mediante corte o digestión, reactivos frescos y un tiempo de desnaturalización suficiente es crucial para la desnaturalización completa [ 5 ] Otra técnica sugerida es llevar a cabo la reacción con bisulfito a 95  °C aunque la degradación del ADN también ocurre a altas temperaturas. [ 5 ] En la primera hora de reacción con bisulfito, se predice que menos del 90 % del ADN de la muestra se pierde por degradación [ 6 ] Se requiere un equilibrio entre alta y baja temperatura para asegurar la desnaturalización completa y disminuir la degradación del ADN. También se puede emplear el uso de reactivos, como la urea, que impiden la formación de dsDNA. [ 5 ] Con la contaminación de dsDNA, puede ser difícil calcular los datos con precisión. [ 1 ] Cuando se observa una citosina no convertida, es difícil diferenciar entre la falta de metilación y un artefacto. [ 1 ]

Significado

La importancia de esta técnica radica en que permite la secuenciación de áreas metiladas que no pueden perfilarse adecuadamente mediante técnicas convencionales de secuenciación con bisulfito. Las tecnologías de secuenciación actuales presentan limitaciones en cuanto al perfilado de áreas de secuencias repetidas. [ 7 ] Esto resulta problemático para los estudios de metilación, ya que estas secuencias repetidas suelen contener citosinas metiladas. Esto limita especialmente los estudios que implican el perfilado de genomas cancerosos , dado que se observa una pérdida de metilación en estas secuencias repetidas en muchos tipos de cáncer. [ 8 ] RRBS elimina los problemas derivados de estas extensas áreas de secuencias repetidas y, por lo tanto, permite una anotación más completa de estas regiones.

Aplicaciones

Metilomas en la genómica del cáncer

Se ha observado metilación aberrante en el cáncer. [ 9 ] En el cáncer, se ha visto hipermetilación así como hipometilación en tumores. [ 9 ] Dado que RRBS es altamente sensible, esta técnica puede usarse para observar rápidamente la metilación aberrante en el cáncer. [ 10 ] Si se pueden obtener muestras del tumor del paciente y células normales, se puede observar una comparación entre estos dos tipos de células. [ 2 ] [ 10 ] Se puede producir un perfil de la metilación general de manera bastante rápida. [ 2 ] Esta técnica puede determinar rápidamente el estado de metilación general de los genomas cancerosos que es rentable y eficiente en tiempo.

Estados de metilación en el desarrollo

En todos los organismos vivos se pueden observar cambios específicos de cada etapa de desarrollo. Las modificaciones en los niveles generales de metilación, detectadas mediante secuenciación con bisulfito de representación reducida, pueden resultar útiles en biología del desarrollo.

Comparación con otras técnicas

Los resultados comparados entre RRBS y MethylC-seq son altamente concordantes entre sí. [ 11 ] Naturalmente, MethylC-seq tiene una mayor cobertura de CpGs en todo el genoma en comparación con RRBS, pero RRBS tiene una mayor cobertura en islas CpG. [ 11 ] Otra de las técnicas más comúnmente utilizadas para perfilar la metilación es MeDiP-Seq. Esta técnica se realiza mediante inmunoprecipitación de citosinas metiladas y posterior secuenciación. [ 11 ] RRBS tiene una mayor resolución en comparación con esta técnica, ya que MeDip-Seq está limitado a 150 pares de bases en comparación con la resolución de un nucleótido de RRBS. [ 11 ] Los métodos de bisulfito, como el utilizado por RRBS, también se encontraron más precisos que los basados ​​en enriquecimiento, como MeDip-Seq. [ 7 ] Los datos obtenidos en RRBS y la metilación de Illumina Infinium son altamente comparables, con una correlación de Pearson de 0,92. [ 7 ] Los datos de ambas plataformas también son directamente comparables, ya que ambas utilizan una medición absoluta del ADN.

Finalmente, el grupo de Ben Delatte en Active Motif desarrolló la secuenciación de bisulfito basada en anclas (ABBS). Esta tecnología utiliza cebadores especializados que capturan la metilación del ADN, lo que permite una mayor cobertura (aproximadamente 10 veces más que WGBS) y reduce los costos de secuenciación. También demostraron que ABBS no es tan restrictiva como RRBS y puede utilizarse como alternativa a MeDIP-seq manteniendo la resolución de bases. [ 12 ]

Referencias

  1. 1 2 3 4 5 6 Alexander Meissner, Andreas Gnirke, George W. Bell, Bernard Ramsahoye, Eric S. Lander y Rudolf Jaenisch. 2005. «Secuenciación de bisulfito de representación reducida para el análisis comparativo de metilación de ADN de alta resolución». Nucleic Acids Res . 33(18):5868-77
  2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gu H, Smith ZD, Bock C, Boyle P, Gnirke A, Meissner A. 2011. "Preparación de bibliotecas de secuenciación de bisulfito de representación reducida para la elaboración de perfiles de metilación de ADN a escala genómica." Nat Protoc . 6(4):468-81. doi : 10.1038/nprot.2010.190 .
  3. ↑ Chatterjee A, Rodger EJ, Stockwell PA, Weeks RJ, Morison IM. 2012. "Consideraciones técnicas para la secuenciación de bisulfito de representación reducida con bibliotecas multiplexadas." J Biomed Biotechnol . 2012:741542. doi : 10.1155/2012/741542
  4. ↑ Trucchi, Emiliano; Mazzarella, Anna B.; Gilfillan, Gregor D.; Lorenzo, Maria T.; Schönswetter, Peter; Paun, Ovidiu (abril de 2016). " BsRADseq: detección de metilación del ADN en poblaciones naturales de especies no modelo" . Molecular Ecology . 25 (8): 1697–1713 . doi : 10.1111/mec.13550 . PMC 4949719. PMID 26818626 .  
  5. 1 2 3 Warnercke, PM Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, JR, Clark, SJ 2002. "Identificación y resolución de artefactos en la secuenciación con bisulfito." Methods. 27: 101-107.
  6. ↑ Grunau, C., Clark, SJ y Rosenthal, A. 2001. "Secuenciación genómica con bisulfito: investigación sistemática de parámetros experimentales críticos." Nucleic Acids Res ., 29, E65–65.
  7. 1 2 3 Bock C, Tomazou EM, Brinkman AB, Müller F, Simmer F, Gu H, Jäger N, Gnirke A, Stunnenberg HG, Meissner A. 2010. "Comparación cuantitativa de tecnologías de mapeo de metilación de ADN en todo el genoma." Nat Biotechnol . 28(10):1106-14. doi : 10.1038/nbt.1681
  8. ↑ Ehrlich M. 2009. "Hipometilación del ADN en células cancerosas". Epigenomics . 1(2):239-59. doi : 10.2217/epi.09.33 .
  9. 1 2 Veersteeg, R. 1997. Metilación aberrante en el cáncer. American Journal of Human Genetics. 60:751-754.
  10. 1 2 Smith, ZD, Gu, H., Bock, C., Gnike, A., & Meissner, A. 2009. Secuenciación de bisulfito de alto rendimiento en genomas de mamíferos. Methods. 48: 226-232.
  11. 1 2 3 4 Harris, Alan et al. 2010. “Comparación de métodos basados ​​en secuenciación para perfilar la metilación del ADN e identificación de modificaciones epigenéticas monoalélicas” Nature Biotechnology 28:1097-1105.
  12. ↑ Chapin, N., Fernandez, J., Poole, J. et al. La secuenciación de bisulfito basada en anclaje determina la metilación del ADN en todo el genoma. Commun Biol 5, 596 (2022).