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Articulo de referencia

MALBAC

Los ciclos de amplificación basados ​​en recocido múltiple y bucle ( MALBAC ) son un método de amplificación de genoma completo cuasilineal. A diferencia de los métodos convenci...

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Los ciclos de amplificación basados ​​en recocido múltiple y bucle ( MALBAC ) son un método de amplificación de genoma completo cuasilineal. A diferencia de los métodos convencionales de amplificación de ADN , que son no lineales o exponenciales (en cada ciclo, el ADN copiado puede servir como plantilla para ciclos posteriores), MALBAC utiliza cebadores especiales que permiten que los amplicones tengan extremos complementarios y, por lo tanto, formen bucles, evitando que el ADN se copie exponencialmente. Esto da como resultado la amplificación únicamente del ADN genómico original y, por lo tanto, reduce el sesgo de amplificación. MALBAC se utiliza para crear amplicones de secuenciación aleatoria superpuestos que cubren la mayor parte del genoma. [ 1 ] Para la secuenciación de próxima generación, MALBAC se complementa con una PCR convencional que se utiliza para amplificar aún más los amplicones.

Plataforma tecnológica

Antes de la técnica MALBAC, se aísla una sola célula mediante diversos métodos, como la microdisección por captura láser , dispositivos microfluídicos , citometría de flujo o micropipeteo, y posteriormente se lisa. La amplificación del genoma completo de una sola célula mediante MALBAC implica 5 ciclos de extinción, extensión, fusión y formación de bucles.

Cebadores MALBAC

La principal ventaja de MALBAC es que el ADN se amplifica casi linealmente. La utilización de cebadores especializados permite la formación de bucles en los amplicones, lo que impide su posterior amplificación en ciclos subsiguientes de MALBAC. Estos cebadores tienen 35 nucleótidos de longitud, con 8 nucleótidos variables que se hibridan con las plantillas y 27 nucleótidos comunes. [ 1 ] La secuencia de nucleótidos comunes es GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG. Los 8 nucleótidos variables se hibridan aleatoriamente con la molécula de ADN genómico monocatenario. Tras una extensión, se obtiene un semiamplicón, un amplicón que contiene la secuencia de nucleótidos comunes solo en el extremo 5'. Este semiamplicón se utiliza como plantilla para otra ronda de extensión, que da como resultado un amplicón completo, un amplicón cuyo extremo 3' es complementario a la secuencia del extremo 5'.

Desplazamiento de hebras

Los cebadores MALBAC tienen componentes variables que les permiten unirse aleatoriamente al ADN molde. Esto significa que en un mismo fragmento, en cualquier ciclo, pueden estar unidos varios cebadores. Una ADN polimerasa, como la derivada de Bacillus stearothermophilus ( polimerasa Bst ), puede desplazar el extremo 5' de otra hebra corriente arriba que crece en la misma dirección. [ 2 ]

Tasa de error

La ADN polimerasa Bst tiene una tasa de error de 1/10000 bases. [ 3 ]

Flujo de trabajo experimental

Descripción general del flujo de trabajo de un experimento MALBAC.
  1. Aislamiento y lisis de células individuales : se utilizan como plantillas fragmentos de ADN genómico (de 10 a 100 kb) aislados de una sola célula, en porcentajes de picogramos (pg).
  2. Fusión : A 94  °C, las moléculas de ADN de doble cadena se funden y se convierten en moléculas de cadena simple.
  3. Enfriamiento rápido : Después de la fusión, la reacción se enfría inmediatamente a 0  °C y se añaden los imprimadores MALBAC a la reacción.
  4. Extensión : la ADN polimerasa Bst (fragmento grande) extiende los cebadores a 65  °C durante 2 minutos, creando semi-amplicones.
  5. Fusión : La reacción se calienta de nuevo a 94  °C para separar el semiamplicón de la plantilla de ADN genómico.
  6. Inactivación : La reacción se detiene rápidamente a 0  °C, seguida de la adición de la misma mezcla de polimerasa. Los cebadores MALBAC se unen eficazmente tanto a los semiamplicones como a la plantilla de ADN genómico.
  7. Extensión : la ADN polimerasa Bst  (fragmento grande) extiende los cebadores a 65 °C durante 2 minutos. En este paso, se generan amplicones completos para aquellos que utilizaron semi-amplicones como plantillas, y también se generan semi-amplicones para aquellos que utilizaron la plantilla de ADN genómico como plantilla.
  8. Fusión : La reacción se calienta a 94  °C para separar los amplicones de la plantilla.
  9. Formación de bucles : En el caso de amplicones completos, la secuencia del extremo 3' es ahora complementaria al extremo 5'. A 58  °C, ambos extremos se hibridan formando un bucle de ADN. Esto impide que el amplicón completo se utilice como plantilla en ciclos MALBAC posteriores.
  10. Repita los pasos 6 a 9 cinco veces : 5 ciclos de amplificación lineal MALBAC.
  11. PCR convencional : El producto MALBAC se amplifica posteriormente mediante PCR. Al utilizar los 27 nucleótidos comunes como cebadores, solo se amplifican los amplicones completos.

Al final de la PCR, los picogramos de material genético se amplifican hasta obtener microgramos de ADN, lo que produce suficiente ADN para su secuenciación.

Aplicaciones

Detección de genes de resistencia a fármacos mediante MALBAC

MALBAC ofrece un enfoque imparcial para la amplificación de ADN de una sola célula. Este método de secuenciación de células individuales tiene una gran cantidad de aplicaciones, muchas de las cuales aún no se han explotado. MALBAC puede ayudar en el análisis de muestras forenses, en el cribado prenatal de enfermedades genéticas, en la comprensión del desarrollo de las células reproductivas o en la elucidación de la complejidad de un tumor. [ 1 ] [ 4 ] En su base, esta tecnología permite a los investigadores observar la frecuencia con la que se acumulan mutaciones en células individuales. [ 1 ] Además, permite la detección de anomalías cromosómicas y variaciones en el número de copias génicas (CNV) dentro y entre células, y facilita aún más la detección de mutaciones poco comunes que dan lugar a polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [ 1 ]

En el campo de la investigación del cáncer , MALBAC tiene muchas aplicaciones. Puede utilizarse para examinar la heterogeneidad intratumoral, para identificar genes que pueden conferir un fenotipo agresivo o metastásico, o para evaluar el potencial de un tumor para desarrollar resistencia a los fármacos . [ 4 ] [ 5 ] Una aplicación pionera de MALBAC se publicó en un número de diciembre de 2012 de Science y describió el uso de esta tecnología para medir la tasa de mutación de la línea celular de cáncer de colon SW4802. [ 1 ] Mediante la secuenciación del ADN amplificado de tres células de cáncer de colon emparentadas en paralelo con células de cáncer de colon no relacionadas de un linaje diferente, se identificaron SNP sin detectarse falsos positivos. [ 1 ] También se observó que las transversiones purina-pirimidina ocurrían con alta frecuencia entre los SNP. [ 1 ] La caracterización del número de copias y las variaciones de un solo nucleótido de células individuales de cáncer de colon puso de relieve la heterogeneidad presente dentro de un tumor. [ 1 ]

MALBAC se ha aplicado como método para examinar la diversidad genética entre las células reproductivas. Mediante la secuenciación de los genomas de 99 espermatozoides humanos individuales de un donante anónimo, MALBAC se utilizó para examinar eventos de recombinación genética que involucran gametos individuales y, en última instancia, proporcionar información sobre la dinámica de la recombinación genética y su contribución a la infertilidad masculina. [ 6 ] Además, dentro de un espermatozoide individual, MALBAC identificó cromosomas duplicados o faltantes, así como SNP o CNV que podrían afectar negativamente la fertilidad. [ 6 ]

Ventajas

MALBAC ha dado lugar a muchos avances significativos con respecto a otras técnicas de secuenciación de células individuales, principalmente porque puede informar el 93 % del genoma de una sola célula humana. [ 1 ] Algunas ventajas de esta tecnología incluyen un sesgo de amplificación reducido y una mayor cobertura del genoma , el requerimiento de muy poco ADN molde y bajas tasas de mutaciones falsas positivas y falsas negativas. [ 4 ] [ 6 ]

Reduce el sesgo de amplificación y aumenta la cobertura del genoma.

MALBAC es una forma de secuenciación del genoma completo que reduce el sesgo asociado con la amplificación exponencial de PCR mediante el uso de una fase cuasilineal de preamplificación. [ 1 ] MALBAC utiliza cinco ciclos de preamplificación y cebadores que contienen una secuencia común de 27 nucleótidos y una secuencia variable de 8 nucleótidos para producir fragmentos de ADN amplificado (amplicones) que se pliegan sobre sí mismos para evitar copias adicionales e hibridación cruzada. [ 1 ] [ 7 ] Estos bucles no pueden usarse como plantilla para la amplificación durante MALBAC y, por lo tanto, reducen el sesgo de amplificación comúnmente asociado con la amplificación exponencial desigual de fragmentos de ADN por reacción en cadena de la polimerasa. [ 1 ] Se ha descrito que MALBAC tiene una mejor uniformidad de amplificación que otros métodos de secuenciación simple, como la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA). [ 1 ] [ 5 ] MDA no utiliza el bucle de ADN y amplifica el ADN de manera exponencial, lo que resulta en sesgo. [ 1 ] En consecuencia, el sesgo de amplificación asociado con otros métodos de secuenciación de células individuales da como resultado una baja cobertura del genoma. [ 1 ] [ 5 ] El sesgo reducido asociado con MALBAC ha generado una mejor cobertura de secuencia del genoma que otros métodos de secuenciación de células individuales.

Requiere muy poca cantidad de ADN molde.

MALBAC se puede utilizar para amplificar y posteriormente secuenciar ADN cuando solo se dispone de una o pocas células, como en el análisis de células tumorales circulantes, pruebas prenatales o muestras forenses. [ 4 ] [ 7 ] Solo se requiere una pequeña cantidad de plantilla inicial (picogramos de ADN) para iniciar el proceso, por lo que es un método ideal para la secuenciación de una sola célula humana. [ 1 ]

Baja incidencia de mutaciones falsas positivas y falsas negativas.

La secuenciación de células individuales suele tener una alta tasa de mutaciones falsas negativas. [ 1 ] Una tasa de mutación falsa negativa se define como la probabilidad de no detectar una mutación real, y esto puede ocurrir debido a un sesgo de amplificación resultante de la pérdida, o abandono, de un alelo. [ 8 ] La uniformidad de la cobertura de secuencia de MALBAC en comparación con otras técnicas de secuenciación de células individuales ha mejorado la detección de SNP y reducido la tasa de abandono de alelos . [ 1 ] La tasa de abandono de alelos aumenta cuando un alelo de un heterocigoto no se amplifica, lo que resulta en la identificación de un "homocigoto falso". Esto puede ocurrir debido a una baja concentración de plantilla de ADN, o a la amplificación desigual de la plantilla, lo que resulta en que un alelo de un heterocigoto se copie más que el otro. [ 8 ] Se ha demostrado que la tasa de abandono de alelos de MALBAC es mucho menor (aproximadamente 1%) en comparación con MDA, que es aproximadamente 65%. A diferencia de MDA, que ha demostrado tener una eficiencia de detección de SNP del 41 % en comparación con la secuenciación masiva, se ha informado que MALBAC tiene una eficiencia de detección de SNP del 76 %. [ 1 ] También se ha informado que MALBAC tiene una baja tasa de falsos positivos . Las mutaciones falsas positivas generadas por MALBAC resultan en gran medida de errores introducidos por la ADN polimerasa durante el primer ciclo de amplificación, que se propagan durante los ciclos subsiguientes. Esta tasa de falsos positivos puede eliminarse secuenciando 2-3 células dentro de un linaje derivado de una sola célula para verificar la presencia de un SNP, y eliminando los errores de secuenciación y amplificación mediante la secuenciación de células no relacionadas de un linaje separado. [ 1 ]

Limitaciones

  • Debido a la necesidad de una cantidad baja de ADN molde, la contaminación del ADN objetivo por parte del operador o del entorno puede potencialmente confundir los resultados de la secuenciación. [ 1 ]
  • Para descartar por completo los falsos positivos, es necesario comparar los resultados de la secuenciación celular con los obtenidos de 2-3 células dentro del mismo linaje, así como con células de un linaje no relacionado. [ 1 ]
  • La ADN polimerasa utilizada para amplificar el ADN molde es propensa a errores y puede introducir errores de secuenciación en el primer ciclo de MALBAC que posteriormente se propagan. [ 1 ] [ 4 ]
  • La cobertura del genoma a nivel de célula individual mediante MALBAC es menos uniforme que la secuenciación masiva. Aunque MALBAC ha mejorado la eficiencia de detección de la secuenciación de células individuales, no puede detectar aproximadamente un tercio de los SNP en comparación con la secuenciación masiva. [ 1 ] [ 4 ]
  • Base de datos del NCBI
  • Yikon Genomics: Amplificación del genoma completo (WGA) y ciclos de amplificación basados ​​en hibridación múltiple y bucles (MALBAC)

Referencias

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Zong, C.; Lu, S.; Chapman, AR; Xie, S. (2012). "Detección a nivel genómico de variaciones de un solo nucleótido y del número de copias de una sola célula humana." Science 338, 1622. DOI: 10.1126/science.1229164. PMID 23258894 
  2. ↑ "Aviel-Ronen, S.; Qi Zhu, C.; Coe, BP; Liu, N.; Watson, SK; Lam, WL; Tsao, MS (2006) "ADN polimerasa Bst de fragmentos grandes para la amplificación del genoma completo de ADN de tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina." BMC Genomics 7. DOI:10.1186/1471-2164-7-312. PMID 17156491 
  3. ↑ PROTOCOLOS ACTUALES EN BIOLOGÍA MOLECULAR, Ausubel, FM et al. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc. 1995. Págs. 7.4.18.
  4. 1 2 3 4 5 6 Baker, M. (2012). "Método ofrece un modelo de una sola célula humana." Nature News. doi : 10.1038/nature.2012.12088
  5. 1 2 3 Navin, N.; Kendall, J.; Troge, J.; Andrews, P.; Rodgers, L.; McIndoo, J.; Cook, K.; Stepansky, A.; Levy, D.; Esposito, D.; Muthuswamy, L.; Krasnitz, A.; McCombie, R.; Hicks, J.; Wigler, M. (2011). "Evolución tumoral inferida mediante secuenciación de células individuales." Nature Letter 472, 90-94. DOI: 10.1038/nature09807. PMID 21399628 
  6. 1 2 3 Lu, S.; Zong, C.; Fan, W.; Yang, M.; Li, J.; Chapman, AR; Zhu, P.; Hu, X.; Xu, L.; Yan, L.; Bai, F.; Qiao, J.; Tang, F.; Li, R.; Xie, S. (2012). "Análisis de la recombinación meiótica y la aneuploidía de espermatozoides individuales mediante secuenciación del genoma completo." Science 338, 1627. DOI: 10.1126/science.1229112. PMID 23258895 
  7. 1 2 Reuell, P. (2013). "Una sola célula es todo lo que necesitas: una técnica innovadora puede secuenciar el genoma completo a partir de una sola célula." Harvard Gazette. http://news.harvard.edu/gazette/story/2013/01/one-cell-is-all-you-need/
  8. 1 2 Miller, CR; Joyce, P.; Waits, LP (2002). "Evaluación de la pérdida alélica y la fiabilidad del genotipo mediante máxima verosimilitud." Genetics 160 (1) 357-366. PMID 11805071