Amplificación de desplazamiento múltiple

La ADN polimerasa del bacteriófago Φ29 es una enzima de alta procesividad que puede producir amplicones de ADN de más de 70 kilobases. ^{[ 1 ]} Su alta fidelidad y actividad correctora de pruebas 3' - 5' reducen la tasa de error de amplificación a 1 en 10 ⁶ − 10 ⁷ bases en comparación con la polimerasa Taq convencional , que tiene una tasa de error reportada de 1 en 9000. ^{[ 2 ]} La reacción se puede llevar a cabo en condiciones isotérmicas moderadas de 30  °C y, por lo tanto, no requiere un termociclador . Se ha utilizado activamente en la clonación libre de células, que es el método enzimático de amplificación de ADN in vitro sin cultivo celular ni extracción de ADN . El fragmento grande de la ADN polimerasa Bst también se utiliza en MDA, pero Φ29 es generalmente preferida debido a su rendimiento de producto suficiente y su actividad correctora de pruebas. ^{[ 3 ]}

Los cebadores hexaméricos son secuencias compuestas por seis nucleótidos aleatorios . Para aplicaciones de MDA, estos cebadores suelen estar modificados con tiofosfato en su extremo 3' para conferirles resistencia a la actividad exonucleasa 3' - 5' de la ADN polimerasa β29 . Las reacciones de MDA comienzan con la hibridación de dichos cebadores a la plantilla de ADN, seguida de la elongación de la cadena mediada por la polimerasa. A lo largo de la reacción de amplificación, se produce un número creciente de eventos de hibridación de cebadores.

La reacción de amplificación se inicia cuando múltiples hexámeros de cebadores se unen al molde. Cuando la síntesis de ADN avanza al siguiente sitio de inicio, la polimerasa desplaza la cadena de ADN recién producida y continúa su elongación. El desplazamiento de la cadena genera un nuevo molde de ADN monocatenario para que más cebadores se unan. El posterior apareamiento de los cebadores y el desplazamiento de la cadena en el molde recién sintetizado dan como resultado una red de ADN hiperramificada. La desramificación de la secuencia durante la amplificación produce un alto rendimiento de los productos. Para separar la red de ramificación del ADN, se utilizan nucleasas S1 para cortar los fragmentos en los sitios de desplazamiento. Las muescas en los fragmentos de ADN resultantes son reparadas por la ADN polimerasa I.

La MDA puede generar 1-2 μg de  ADN a partir de una sola célula con una cobertura genómica de hasta el 99%. ^{[ 4 ]} Los productos también tienen una tasa de error menor y tamaños mayores en comparación con la amplificación Taq basada en PCR . ^{[ 4 ] [ 5 ]}

Flujo de trabajo general de MDA: ^{[ 6 ]}

1. Preparación de la muestra : Las muestras se recogen y se diluyen en el tampón de reacción apropiado (libre de Ca ²⁺ y Mg ²⁺ ). Las células se lisan con tampón alcalino .
2. Condiciones : La reacción de MDA con la polimerasa Ф29 se lleva a cabo a 30  °C. La reacción suele durar entre 2,5 y 3 horas.
3. Fin de la reacción : Inactivar las enzimas a 65  °C antes de recolectar los productos de ADN amplificados.
4. Los productos de ADN se pueden purificar con un kit de purificación comercial.

La ADO se define como la no amplificación aleatoria de uno de los alelos presentes en una muestra heterocigota . Algunos estudios han reportado una tasa de ADO de los productos MDA de 0 a 60 %. ^{[ 7 ]} Este inconveniente disminuye la precisión del genotipado de una sola muestra y provoca diagnósticos erróneos en otras aplicaciones que involucran MDA. La ADO parece ser independiente del tamaño de los fragmentos y se ha reportado que tiene una tasa similar en otras técnicas de célula única. Posibles soluciones son el uso de diferentes condiciones de lisis o realizar múltiples rondas de amplificación a partir de los productos MDA diluidos, ya que se ha reportado que la amplificación mediada por PCR a partir de células cultivadas produce tasas de ADO más bajas.

La «amplificación preferencial» consiste en la sobreamplificación de uno de los alelos en comparación con el otro. La mayoría de los estudios sobre MDA han reportado este problema. Actualmente, se observa que el sesgo de amplificación es aleatorio. Esto podría afectar el análisis de pequeños fragmentos de ADN genómico para la identificación de alelos de repeticiones cortas en tándem (STR).

La interacción endógena entre cebadores, independiente de la plantilla, se debe al diseño aleatorio de los cebadores hexaméricos. Una posible solución consiste en diseñar cebadores hexanucleotídicos aleatorios y restringidos que no se hibriden de forma cruzada.

Se han secuenciado células individuales de bacterias, arqueas y protistas no cultivadas, así como partículas virales individuales y esporas fúngicas individuales con la ayuda de MDA. ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]}

La capacidad de secuenciar células individuales también es útil para combatir enfermedades humanas. Se han amplificado con éxito genomas de células embrionarias humanas individuales para su secuenciación mediante MDA, lo que permite el diagnóstico genético preimplantacional (DGP): la detección de problemas de salud genética en un embrión en etapa temprana antes de la implantación . ^{[ 19 ]} Las enfermedades con propiedades heterogéneas , como el cáncer , también se benefician de la capacidad de la secuenciación del genoma basada en MDA para estudiar mutaciones en células individuales.

Los productos MDA obtenidos a partir de una sola célula también se han utilizado con éxito en experimentos de hibridación genómica comparativa en microarrays , que normalmente requieren una cantidad relativamente grande de ADN amplificado.

La inmunoprecipitación de cromatina produce mezclas complejas de fragmentos de ADN relativamente cortos, cuya amplificación mediante MDA resulta compleja sin generar sesgos en la representación de los fragmentos. Se propuso un método para sortear este problema, basado en la conversión de estas mezclas en concatémeros circulares mediante ligación, seguida de MDA mediada por la ADN polimerasa Φ29. ^{[ 20 ]}

La mínima cantidad de muestras recogidas en las escenas del crimen puede amplificarse mediante MDA hasta alcanzar la cantidad suficiente para el análisis forense de ADN, que se utiliza habitualmente para identificar a víctimas y sospechosos.