extracción de ADN

El primer aislamiento de ácido desoxirribonucleico (ADN) fue realizado en 1869 por Friedrich Miescher . ^{[ 1 ]} La extracción de ADN es el proceso de aislar el ADN de las células de un organismo a partir de una muestra, generalmente biológica, como sangre, saliva o tejido. Consiste en romper las células, eliminar proteínas y otros contaminantes, y purificar el ADN para que quede libre de otros componentes celulares. El ADN purificado puede utilizarse posteriormente para aplicaciones como PCR , ^{[ 2 ]} secuenciación o clonación . Actualmente, es un procedimiento rutinario en biología molecular y análisis forenses .

Este proceso puede realizarse de varias maneras, dependiendo del tipo de muestra y la aplicación posterior, ^{[ 3 ]} los métodos más comunes son: lisis mecánica, química y enzimática, precipitación, purificación y concentración. El método específico utilizado para extraer el ADN, como la extracción con fenol-cloroformo, la precipitación con alcohol o la purificación con sílice. ^{[ 4 ]}

Para el método químico, se utilizan muchos kits diferentes para la extracción, y seleccionar el correcto ahorrará tiempo en la optimización del kit y los procedimientos de extracción. Se considera la detección de la sensibilidad de la PCR para mostrar la variación entre los kits comerciales. ^{[ 5 ]}

Existen muchos métodos diferentes para extraer ADN, pero algunos pasos comunes incluyen:

1. Lisis: Este paso consiste en romper las células para liberar el ADN. Por ejemplo, en el caso de las células bacterianas, se puede utilizar una solución de detergente y sal (como SDS ) para romper la membrana celular y liberar el ADN. Para las células vegetales y animales, se suelen utilizar métodos mecánicos o enzimáticos.
2. Precipitación: Una vez liberado el ADN, es necesario eliminar las proteínas y otros contaminantes. Esto se suele hacer añadiendo un agente precipitante, como un alcohol (por ejemplo, etanol o isopropanol) o una sal (por ejemplo, acetato de amonio ). El ADN formará un sedimento en el fondo de la solución, mientras que los contaminantes permanecerán en el líquido.
3. Purificación: Tras la precipitación del ADN, este suele purificarse mediante métodos basados ​​en columnas. Por ejemplo, se pueden utilizar columnas de centrifugación de sílice para fijar el ADN, mientras que los contaminantes se eliminan mediante lavado. Otra opción es la centrifugación , que permite purificar el ADN depositándolo en el fondo del tubo.
4. Concentración: Finalmente, la cantidad de ADN presente se suele aumentar eliminando el líquido restante. Esto se suele hacer mediante centrifugación al vacío o liofilización .

Dependiendo del protocolo específico de extracción de ADN, pueden utilizarse algunas variaciones de estos pasos. Además, existen kits comerciales que incluyen reactivos y protocolos específicamente adaptados a un tipo de muestra concreto. ^{[ 6 ]}

La extracción de ADN es frecuentemente un paso preliminar en muchos procedimientos de diagnóstico utilizados para identificar virus y bacterias ambientales y diagnosticar enfermedades y dolencias hereditarias. Estos métodos incluyen, entre otros:

La técnica de hibridación fluorescente in situ (FISH) se desarrolló en la década de 1980. La idea básica consiste en utilizar una sonda de ácido nucleico para hibridar el ADN nuclear de células en interfase o cromosomas en metafase adheridos a una lámina microscópica. Es un método molecular que se utiliza, entre otras cosas, para reconocer y contar grupos bacterianos específicos. ^{[ 1 ]}

Para reconocer, definir y cuantificar los patrones geográficos y temporales en las comunidades de bacterioplancton marino, los investigadores emplean una técnica llamada polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP, por sus siglas en inglés).

Secuenciación: Genomas completos o parciales y otros componentes cromosómicos, terminados para su comparación con secuencias publicadas previamente. ^{[ 7 ]}

• Es necesario recolectar las células que se van a estudiar.
• Al romperse las membranas celulares , se expone el ADN junto con el citoplasma en su interior ( lisis celular ).
  • Los lípidos de la membrana celular y del núcleo se descomponen con detergentes y tensioactivos .
  • Descomponer las proteínas añadiendo una proteasa (opcional).
  • Descomposición del ARN mediante la adición de una ARNasa (opcional).
• La solución se trata con una solución salina concentrada (solución salina) para que los residuos, como proteínas rotas, lípidos y ARN, se agrupen.
• La centrifugación de la solución separa los restos celulares aglomerados del ADN.
• La purificación del ADN, eliminando detergentes, proteínas, sales y reactivos, se utiliza durante la etapa de lisis celular. Los procedimientos más utilizados son:
  • La precipitación del ADN se realiza generalmente con etanol o isopropanol muy fríos . Dado que el ADN es insoluble en estos alcoholes, se agrupará, formando un precipitado al centrifugarlo . La precipitación del ADN mejora al aumentar la fuerza iónica, generalmente añadiendo acetato de sodio .
  • Extracción con fenol-cloroformo, en la que el fenol desnaturaliza las proteínas de la muestra. Tras la centrifugación, las proteínas desnaturalizadas permanecen en la fase orgánica, mientras que la fase acuosa, que contiene el ácido nucleico, se mezcla con cloroformo para eliminar los residuos de fenol de la solución.
  • La purificación mediante minicolumnas se basa en el hecho de que los ácidos nucleicos pueden unirse ( adsorción ) a la fase sólida (sílice u otra) dependiendo del pH y la concentración de sal del tampón.

Las proteínas celulares e histonas unidas al ADN pueden eliminarse añadiendo una proteasa o bien precipitando las proteínas con acetato de sodio o de amonio , o extrayéndolas con una mezcla de fenol-cloroformo antes de la precipitación del ADN.

Tras su aislamiento, el ADN se disuelve en una solución tampón ligeramente alcalina, generalmente en una solución tampón TE , o en agua ultrapura .

Los productos químicos más comunes utilizados para la extracción de ADN incluyen:

1. Detergentes como el SDS o el Tween-20, que se utilizan para romper las células y liberar el ADN.
2. Las enzimas proteasas, como la proteinasa K, se utilizan para digerir las proteínas que pueden estar uniéndose al ADN.
3. El fenol y el cloroformo se utilizan para separar el ADN de otros componentes celulares.
4. Etanol o isopropanol, que se utilizan para precipitar el ADN.
5. La sal, como el NaCl, se utiliza a menudo para ayudar a disolver el ADN y mantener su estabilidad.
6. El EDTA inactiva enzimas como las nucleasas mediante la quelación (unión) de iones metálicos necesarios como cofactores.
7. Tris-HCl, que se utiliza para mantener el pH en las condiciones óptimas para la extracción de ADN.

Algunos de los métodos más comunes de extracción de ADN incluyen la extracción orgánica , la extracción con Chelex y la extracción en fase sólida . ^{[ 8 ] [ 9 ]} Estos métodos producen ADN aislado de forma consistente, pero difieren tanto en la calidad como en la cantidad de ADN obtenido. Al seleccionar un método de extracción de ADN, se deben considerar varios factores, como el costo, el tiempo, la seguridad y el riesgo de contaminación.

La extracción orgánica implica la adición de incubación en múltiples soluciones químicas diferentes; ^{[ 9 ]} incluyendo una etapa de lisis , una extracción con fenol-cloroformo, una precipitación con etanol y etapas de lavado. La extracción orgánica se usa frecuentemente en laboratorios porque es económica y produce grandes cantidades de ADN puro. Si bien es sencilla, implica muchos pasos y lleva más tiempo que otros métodos. También implica el uso desfavorable de los químicos tóxicos fenol y cloroformo , y existe un mayor riesgo de contaminación debido a la transferencia del ADN entre múltiples tubos. ^{[ 10 ]} Varios protocolos basados ​​en la extracción orgánica de ADN se desarrollaron eficazmente hace décadas, ^{[ 11 ]} aunque también se han desarrollado y publicado versiones mejoradas y más prácticas de estos protocolos en los últimos años. ^{[ 12 ]}

El método de extracción con Chelex consiste en añadir la resina Chelex a la muestra, hervir la solución, agitarla en vórtex y centrifugarla. Los materiales celulares se unen a las microesferas de Chelex, mientras que el ADN se encuentra en el sobrenadante . ^{[ 10 ]} El método Chelex es mucho más rápido y sencillo que la extracción orgánica, y solo requiere un tubo, lo que disminuye el riesgo de contaminación por ADN. Desafortunadamente, la extracción con Chelex no produce tanta cantidad y el ADN obtenido es monocatenario, lo que significa que solo puede utilizarse para análisis basados ​​en PCR y no para RFLP . ^{[ 10 ]}

La extracción en fase sólida, como la que utiliza un método de extracción basado en columnas de centrifugación, aprovecha el hecho de que el ADN se une a la sílice . La muestra que contiene ADN se añade a una columna que contiene gel de sílice o perlas de sílice y sales caotrópicas . Las sales caotrópicas interrumpen los enlaces de hidrógeno entre las hebras y facilitan la unión del ADN a la sílice al hacer que los ácidos nucleicos se vuelvan hidrofóbicos. Esto expone los residuos de fosfato, dejándolos disponibles para la adsorción. ^{[ 13 ]} El ADN se une a la sílice, mientras que el resto de la solución se lava con etanol para eliminar las sales caotrópicas y otros componentes innecesarios. ^{[ 9 ]} A continuación, el ADN se puede rehidratar con soluciones acuosas de baja concentración salina, lo que permite su elución de las perlas.

Este método produce ADN de alta calidad, mayoritariamente de doble cadena, que puede utilizarse tanto para PCR como para análisis RFLP . Este procedimiento puede automatizarse ^{[ 10 ]} y tiene un alto rendimiento, aunque inferior al del método de fenol-cloroformo . Se trata de un método de un solo paso, es decir, todo el procedimiento se completa en un solo tubo. Esto reduce el riesgo de contaminación, lo que lo hace muy útil para la extracción forense de ADN. Existen varios kits comerciales de extracción en fase sólida fabricados y comercializados por diferentes empresas; el único inconveniente es que son más caros que la extracción orgánica o la extracción con Chelex.

Para el aislamiento de ADN de algunas muestras, es necesario seleccionar técnicas específicas. Las muestras típicas que requieren un aislamiento de ADN complejo son:

• muestras arqueológicas que contienen ADN parcialmente degradado, véase ADN antiguo ^{[ 14 ]}
• muestras que contienen inhibidores de los procedimientos de análisis posteriores, en particular inhibidores de la PCR , como el ácido húmico del suelo, el índigo y otros tintes textiles o la hemoglobina en la sangre.
• muestras de microorganismos con paredes celulares gruesas, por ejemplo, levadura
• muestras que contienen ADN mixto de múltiples fuentes

El ADN extracromosómico suele ser fácil de aislar, especialmente los plásmidos, que pueden aislarse fácilmente mediante la lisis celular seguida de la precipitación de proteínas, lo que atrapa el ADN cromosómico en una fracción insoluble y, tras la centrifugación, el ADN plasmídico puede purificarse de la fracción soluble.

La extracción de ADN de Hirt consiste en el aislamiento de todo el ADN extracromosómico de una célula de mamífero. Este proceso elimina el ADN nuclear de alto peso molecular , dejando únicamente el ADN mitocondrial de bajo peso molecular y cualquier episoma viral presente en la célula.

Un indicador de difenilamina (DPA) confirmará la presencia de ADN. Este procedimiento implica la hidrólisis química del ADN: al calentarlo (p. ej., a ≥95  °C) en ácido, la reacción requiere desoxirribosa y, por lo tanto, es específica para el ADN. En estas condiciones, la 2-desoxirribosa se convierte en aldehído ω-hidroxilevulinato, que reacciona con la difenilamina para producir un compuesto de color azul. La concentración de ADN se puede determinar midiendo la intensidad de la absorbancia de la solución a 600  nm con un espectrofotómetro y comparándola con una curva de calibración de concentraciones conocidas de ADN.

La medición de la intensidad de absorbancia de la solución de ADN a longitudes de onda de 260 nm y 280 nm se utiliza como indicador de la pureza del ADN. El ADN se puede cuantificar cortándolo con una enzima de restricción , separándolo en un gel de agarosa , tiñéndolo con bromuro de etidio (EtBr) u otro colorante y comparando la intensidad del ADN con un marcador de ADN de concentración conocida.

Mediante la técnica Southern blot , este ADN cuantificado puede aislarse y analizarse posteriormente mediante PCR y RFLP . Estos procedimientos permiten diferenciar las secuencias repetidas dentro del genoma. Son estas técnicas las que utilizan los científicos forenses para la comparación, identificación y análisis.

En este método, los núcleos vegetales se aíslan mediante la molienda física de los tejidos y la reconstitución de los núcleos intactos en un tampón de aislamiento nuclear (NIB) único. El ADN de los plastidios se libera de los orgánulos y se elimina con un tampón osmótico mediante lavado y centrifugación. Los núcleos purificados se lisan y se limpian aún más mediante extracción orgánica, y el ADN genómico se precipita con una alta concentración de CTAB. El ADN genómico de alto peso molecular y alta pureza se extrae de los núcleos, se disuelve en un tampón de pH alto, lo que permite su almacenamiento estable a largo plazo. ^{[ 15 ]}

El almacenamiento de ADN es un aspecto importante de los proyectos de extracción de ADN, ya que garantiza la integridad y estabilidad del ADN extraído para aplicaciones posteriores. ^{[ 16 ]}

Un método común para almacenar ADN es la precipitación con etanol, que consiste en añadir etanol y una sal, como cloruro de sodio o acetato de potasio, al ADN extraído para precipitarlo. A continuación, el ADN se centrifuga y se lava con etanol al 70 % para eliminar cualquier contaminante restante. El precipitado de ADN se seca al aire y se resuspende en un tampón, como el tampón Tris-EDTA (TE), para su almacenamiento.

Otro método consiste en congelar el ADN en una solución tampón, como la solución tampón TE, o en un crioprotector como el glicerol o el DMSO, a -20 o -80 grados Celsius. Este método preserva la integridad del ADN y ralentiza la actividad de las enzimas que podrían degradarlo.

Es importante tener en cuenta que la elección del tampón y las condiciones de almacenamiento dependerán de la aplicación posterior para la que se vaya a utilizar el ADN. Por ejemplo, si el ADN se va a utilizar para PCR, se puede almacenar en tampón TE a 4 °C, mientras que si se va a utilizar para almacenamiento a largo plazo o envío, se puede almacenar en etanol a -20 °C. El ADN extraído debe comprobarse periódicamente para verificar su calidad e integridad, por ejemplo, mediante electroforesis en gel o espectrofotometría. También deben controlarse las condiciones de almacenamiento, como la temperatura y la humedad.

También es importante considerar la estabilidad a largo plazo del ADN y su posible degradación con el tiempo. El ADN extraído debe almacenarse durante el menor tiempo posible, y las condiciones de almacenamiento deben elegirse para minimizar el riesgo de degradación.

En general, el ADN extraído debe almacenarse en las mejores condiciones posibles para garantizar su estabilidad e integridad para aplicaciones posteriores.

Existen varias técnicas de control de calidad utilizadas para garantizar la calidad del ADN extraído, entre ellas: ^{[ 17 ]}

• Espectrofotometría : Este es un método ampliamente utilizado para medir la concentración y pureza de una muestra de ADN. La espectrofotometría mide la absorbancia de una muestra a diferentes longitudes de onda, generalmente a 260  nm y 280  nm. La relación entre la absorbancia a 260  nm y 280  nm se utiliza para determinar la pureza de la muestra de ADN. ^{[ 18 ]}
• Electroforesis en gel: Esta técnica se utiliza para visualizar y comparar el tamaño y la integridad de las muestras de ADN. El ADN se carga en un gel de agarosa y luego se somete a un campo eléctrico, lo que provoca su migración a través del gel. La migración del ADN se puede visualizar mediante bromuro de etidio, que se intercala en el ADN y emite fluorescencia bajo luz ultravioleta. ^{[ 19 ]}
• Fluorometría : La fluorometría es un método para determinar la concentración de ácidos nucleicos midiendo la fluorescencia de la muestra al ser excitada por una longitud de onda de luz específica. La fluorometría utiliza colorantes que se unen específicamente a los ácidos nucleicos y presentan una alta intensidad de fluorescencia.
• PCR: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que amplifica una región específica del ADN. También se utiliza como método de control de calidad mediante la amplificación de un pequeño fragmento de ADN. Si la amplificación es exitosa, significa que el ADN extraído es de buena calidad y no está degradado.
• Fluorómetro Qubit: El fluorómetro Qubit es un instrumento que utiliza colorantes fluorescentes para medir la concentración de ADN y ARN en una muestra. Es un método rápido y sensible que se puede utilizar para determinar la concentración de muestras de ADN. ^{[ 17 ]}
• Bioanalizador: El bioanalizador es un instrumento que utiliza electroforesis para separar y analizar muestras de ADN, ARN y proteínas. Puede proporcionar información detallada sobre el tamaño, la integridad y la pureza de una muestra de ADN.

• Método Boom
• Huella genética
• secuenciación de ADN
• Estructura del ADN
• Precipitación con etanol
• Preparación de plásmidos
• reacción en cadena de la polimerasa
• Purificación de ADN SCODA

• Sambrook, Michael R.; Green, Joseph (2012). Molecular Cloning (4th ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Pr. ISBN 1936113422. OCLC 774021237.

• How to extract DNA from anything living
• DNA Extraction Virtual Lab