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Método Boom

El método Boom (también conocido como método de extracción de ácidos nucleicos Boom ) es un método de extracción en fase sólida para aislar ácidos nucleicos de una muestra bioló...

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El método Boom (también conocido como método de extracción de ácidos nucleicos Boom ) es un método de extracción en fase sólida para aislar ácidos nucleicos de una muestra biológica. Este método se caracteriza por "absorber los ácidos nucleicos (AN) a las perlas de sílice".

Descripción general

El método Boom (método de extracción de ácidos nucleicos Boom) [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] es un método de extracción en fase sólida para aislar ácidos nucleicos (AN) [ 9 ] de muestras biológicas. Las perlas de sílice son un elemento clave de este método, capaces de unirse a los ácidos nucleicos en presencia de una sustancia caotrópica según el efecto caotrópico. Este método es uno de los más extendidos [ 6 ] [ 7 ] para aislar ácidos nucleicos de muestras biológicas y se conoce como un método simple, rápido y confiable [ 2 ] para la purificación a pequeña escala de ácidos nucleicos de muestras biológicas.

Se dice que este método fue desarrollado e inventado por Willem R. Boom et al. alrededor de 1990. [ nota 1 ] Si bien el efecto caotrópico era conocido previamente y había sido reportado por otros científicos, [ 10 ] [ nota 2 ] Boom et al. contribuyeron con una optimización del método para materiales de partida complejos, [ 1 ] tales como fluidos corporales y otros materiales de partida biológicos, y proporcionaron un procedimiento corto de acuerdo con la patente estadounidense US5234809 de Boom et al. [ 1 ] Después de que se presentó la patente de Boom et al. [ 1 ] , otras partes también presentaron solicitudes similares [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] .

En sentido estricto, la palabra "sílice" se refería a cristales de SiO₂ ; sin embargo, existen otras formas de partículas de sílice. En particular, el óxido de silicio amorfo y el polvo de vidrio, la alquilsílice, el silicato de aluminio ( zeolita ) o la sílice activada con -NH₂ son adecuados como material de fase sólida para la unión de ácidos nucleicos según este método. Actualmente, los conceptos del método Boom, caracterizado por el uso de partículas de sílice magnéticas, se utilizan ampliamente. Con este método, las microesferas de sílice magnéticas se capturan mediante un colector de microesferas magnéticas, como la pipeta Tajima, [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] el Pick pen(R), [ 3 ] [ 4 ] el colector Quad Pole, [ 17 ] etc.

Procedimiento breve

Figura 1: Método Boom con pipeta Tajima y perlas de sílice magnéticas. [ 14 ] La estructura esquemática de la pipeta Tajima se muestra en la Figura 2. Los aparatos y métodos [ 14 ] están principalmente destinados al sistema inmunitario. Sin embargo, en esta patente también se menciona una realización alternativa para el ensayo de extracción de ácidos nucleicos, y el procedimiento de la Figura 1 es generalmente similar al método Boom.
Figura 2: Estructura esquemática de la pipeta de Tajima

El proceso fundamental para aislar ácido nucleico a partir del material de partida del método Boom consta de los siguientes 4 pasos [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] (Ver Fig. 1).

(a) Lisis y/o homogeneización del material de partida. El lisado del material de partida se obtiene mediante la adición de un detergente en presencia de enzimas degradadoras de proteínas.

b) Mezcla de la sustancia caotrópica y las microesferas de sílice con el material de partida. El lisado del material de partida de (a) se mezcla con microesferas de sílice y cantidades suficientemente grandes de sustancia caotrópica. Debido al efecto caotrópico, los ácidos nucleicos liberados se unirán a las microesferas de sílice casi instantáneamente. De esta forma, se forman complejos de sílice-ácido nucleico. Las razones por las que los ácidos nucleicos y la sílice forman enlaces se describirán en la siguiente sección (Principios básicos).

(c) Lavado de perlas de sílice Las perlas de sílice de (b) se lavan varias veces para eliminar los contaminantes. El proceso de lavado de los complejos de sílice-ácido nucleico (perlas de sílice) generalmente consta de los siguientes pasos:

  • Recolectar perlas de sílice del líquido por ejemplo con una pipeta Tajima (ver Fig. 1,2) o mediante el método Pellet-down (por sedimentación rápida y eliminación del sobrenadante).
  • Mezclar perlas de sílice en el tampón de lavado que contiene sal caotrópica utilizando, por ejemplo, un mezclador de vórtice.
  • Recolectar nuevamente las perlas de sílice redispersadas del tampón de lavado mencionado anteriormente.
  • A continuación, se realiza un lavado sucesivo con una solución de alcohol y agua [ nota 3 ] y luego con acetona.
  • Preferiblemente, las cuentas estarán secas.

d) Separación de los ácidos nucleicos unidos. Los ácidos nucleicos puros se eluyen en un tampón disminuyendo la concentración de la sustancia caotrópica. Los ácidos nucleicos presentes en los complejos sílice-ácido nucleico lavados (y preferiblemente secos) se eluyen en un tampón de elución seleccionado, como el tampón TE, el agua bidestilada, etc. La selección del tampón de elución viene determinada por el uso previsto del ácido nucleico aislado.

De esta forma, se aíslan los ácidos nucleicos puros a partir del material de partida.

Al modificar las condiciones experimentales, especialmente la composición de los reactivos (sustancia caotrópica, tampón de lavado, etc.), se puede lograr un aislamiento más específico. Por ejemplo, algunas composiciones de reactivos son adecuadas para obtener ADN bicatenario largo o ARN monocatenario corto.

Existe una amplia variedad de materiales biológicos de partida, como sangre entera , suero sanguíneo , capa leucocitaria , orina , heces , líquido cefalorraquídeo , esperma , saliva , tejidos , cultivos celulares , productos alimenticios o vacunas . Se requiere la optimización del procedimiento para maximizar el rendimiento de ácidos nucleicos a partir de diferentes materiales de partida o diferentes tipos de ácidos nucleicos (por ejemplo, largos/cortos, ADN/ARN, lineales/circulares, de doble cadena/de cadena simple).

Actualmente, el ensayo que utiliza microesferas magnéticas recubiertas de sílice parece ser el más común. Por lo tanto, en este artículo, "microesferas de sílice" se refiere a microesferas magnéticas recubiertas de sílice, salvo que se indique lo contrario.

Cuentas magnéticas

Varias partículas magnéticas (portadores magnéticos) recubiertas de sílice se utilizan a menudo como perlas recubiertas de sílice [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] La partícula de maghemita (γ-Fe 2 O 3 ) y la partícula de magnetita ( Fe 3 O 4 ), así como una partícula intermedia de óxido de hierro de las mismas, son las más adecuadas como portadores magnéticos.

Generalmente, la calidad de las perlas magnéticas se caracteriza por los siguientes parámetros: [ 18 ] [ 21 ]

Aquí, la "facilidad de recolección" se define y compara mediante:

"Las microesferas magnéticas se recogen en una cantidad no inferior al X  % en peso (aproximadamente el 90  % en peso) en T segundos (aproximadamente 3 segundos) en presencia de un campo magnético de Y gauss (aproximadamente 3000 gauss ) cuando se dispersan en una cantidad de al menos Z mg (aproximadamente 20 mg) en W mL (aproximadamente 1 mL) de una solución acuosa de una muestra que contiene una sustancia biológica".

mientras que la capacidad de captura se define y compara por

"unión con al menos A μg (～0,4 μg) de la sustancia biológica por cada B mg (～1 mg) de la misma cuando se dispersa en una cantidad de al menos Z mg (～20 mg) en W mL (～1 mL) de una solución acuosa de una muestra que contiene una sustancia biológica".

Principios básicos

El principio de este método [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 14 ] se basa en las propiedades de unión de ácidos nucleicos de partículas de sílice o diatomeas en presencia de un agente caotrópico, que sigue el efecto caotrópico .

En pocas palabras, el efecto caotrópico se produce cuando un anión caotrópico en una solución acuosa altera la estructura del agua y debilita la interacción hidrofóbica. [ 22 ] [ 23 ]

En un sentido amplio, "agente caotrópico" se refiere a cualquier sustancia capaz de alterar la estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria de proteínas y ácidos nucleicos, pero dejando al menos intacta la estructura primaria. [ 24 ]

Una solución acuosa de sal caotrópica es un agente caotrópico. Los aniones caotrópicos aumentan la entropía del sistema al interferir con las interacciones intermoleculares mediadas por fuerzas no covalentes como los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y los efectos hidrofóbicos. Ejemplos de ello son las soluciones acuosas de: ion tiocianato , ion yodo , ion perclorato , ion nitrato , ion bromo , ion cloro , ion acetato , ion flúor e ion sulfato , o combinaciones mutuas de estos. Según el método Boom original, la sal de guanidinio caotrópica empleada es preferiblemente tiocianato de guanidinio (GuSCN).

Según el efecto caotrópico, en presencia del agente caotrópico, el agua de hidratación de los ácidos nucleicos se extrae del enlace fosfodiéster del grupo fosfato de la cadena principal del ácido nucleico. De esta forma, el grupo fosfato queda expuesto y se forma una interacción hidrofóbica entre la sílice y dicho grupo fosfato expuesto.

Instrumentos automatizados

pipeta tajima

Los aparatos de extracción de ácidos nucleicos basados ​​en la pipeta Tajima [ 14 ] [ 15 ] (véase la figura 2) son uno de los instrumentos más extendidos para realizar el método Boom. [ 25 ]

La pipeta Tajima fue inventada por Hideji Tajima, [ 14 ] fundador y presidente de Precision System Sciences (PSS) [ 25 ] Inc., un fabricante japonés de instrumentos de precisión y medición. La pipeta Tajima es una tecnología central de PSS Inc. [ 25 ] PSS Inc. proporciona productos OEM basados ​​en esta tecnología (por ejemplo, MagNA Pure(R) ) a varios fabricantes líderes de reactivos como Hoffmann-La Roche , Life Technologies , ... y otros. Después de que se presentó la patente de Tajima et al. [ 14 ] , otras partes también han presentado solicitudes de patente similares [ 16 ] .

La pipeta Tajima realiza un método y procedimiento de control de partículas magnéticas, que permite separar partículas magnéticas combinadas con una sustancia objetivo del líquido mediante fuerza magnética y suspenderlas en dicho líquido.

Configuraciones

La pipeta en sí es un aparato que comprende los siguientes elementos (véase la figura 2). [ 14 ]

punta de pipeta configurada para poder acceder y aspirar/descargar líquido desde/hacia cada uno de los recipientes, teniendo
una parte frontal,
una porción de embalse,
un paso líquido
conectando la parte frontal y la parte del depósito,
una región de separación
en el conducto líquido sometido a la acción de un campo magnético, y
un mecanismo
para aplicar presión negativa o positiva al interior de la porción de la pipeta para aspirar o descargar una sustancia magnética suspendida en líquido dentro o fuera de la porción de la pipeta.
Fuente del campo magnético
dispuestas en la parte exterior y adyacentes a la punta de la pipeta; y
dispositivo de accionamiento de fuente de campo magnético
Para accionar la fuente del campo magnético y aplicar o eliminar un campo magnético hacia o desde la región de separación desde fuera del conducto del líquido. Cuando el imán se acerca a la punta de la pipeta, se aplica un campo magnético; cuando se aleja de la punta de la pipeta, se elimina dicho campo magnético.

Un aparato de extracción de ácidos nucleicos que incorpora pipetas Tajima generalmente consta de: [ 14 ]

Pipeta Tajima mencionada anteriormente ,
Pluralidad de tubos .
Múltiples soportes para los tubos mencionados anteriormente,
Transporte significa
para transportar la pipeta Tajima entre esa pluralidad de tubos (los tubos están sostenidos por un soporte para tubos), y
Dispositivo de control
para controlar los dispositivos mencionados anteriormente.

Mociones

(a) Captura de las microesferas magnéticas. Durante este proceso de succión, cuando el campo magnético se aplica a la región de separación de la punta de la pipeta, desde el exterior de la punta de la pipeta, mediante el imán dispuesto en el exterior de la punta de la pipeta, a medida que el líquido que contiene microesferas magnéticas pasa a través de una región de separación de la punta de la pipeta, las partículas magnéticas son atraídas y retenidas en la pared interior de la región de separación de la punta de la pipeta.

Posteriormente, al descargar dicha solución bajo la condición de que se haya mantenido el campo magnético, solo quedan partículas magnéticas en el interior de la punta de la pipeta. De esta manera, las partículas magnéticas se separan del líquido.

De acuerdo con Tajima, [ 14 ] la altura de succión preferible del líquido de la mezcla es tal que

el nivel inferior del líquido es más alto que el extremo inferior de la región de separación del conducto de líquido (es decir, el nivel inferior del líquido es más alto que el extremo inferior del imán).
cuando se haya extraído todo el líquido de la mezcla,
para garantizar que las partículas magnéticas aspiradas puedan ser detenidas por completo.

En este momento, debido a que las partículas magnéticas están húmedas, permanecen adheridas a la superficie interna de la zona de separación del conducto de líquido de la punta de la pipeta. Si la punta de la pipeta P se mueve o se transporta, las partículas magnéticas no se desprenderán fácilmente.

b) Resuspensión de las microesferas magnéticas capturadas.

Después de que las partículas magnéticas son detenidas de la manera mencionada anteriormente (a),

de modo que la mezcla líquida sin partículas magnéticas se descarga en la porción que contiene el líquido (Recipiente) y se drena, quedando solo las partículas magnéticas en la punta de la pipeta,

Podemos llevar a cabo el proceso de resuspensión.

La resuspensión de las microesferas magnéticas capturadas se detalla en los siguientes pasos. Por supuesto, consideramos el estado en el que se encuentra dicho material magnético capturado por el método mencionado anteriormente.

  • Aspire el líquido, como el tampón de lavado, hacia la punta.
  • Deje de aplicar un campo magnético.
Al "cesar la aplicación de un campo magnético", las partículas magnéticas quedan suspendidas en el líquido.
  • Descargar el líquido (como el tampón de lavado) desde la punta de la pipeta al recipiente (cuando se interrumpe la fuerza magnética generada por el cuerpo del imán).

Operaciones

Un ejemplo del funcionamiento del aparato de extracción de ácidos nucleicos que incorpora la pipeta Tajima se muestra típicamente en la Fig. 1.

Otros métodos

Ejemplos de otros tipos de métodos para dispositivos de captura de partículas magnéticas son los siguientes.

Véase también

Notas

  1. ↑ Estimado a partir de la fecha de prioridad de Boom, et al.; US5234809EP0389063y sus patentes familiares.
  2. ↑ Los siguientes artículos fueron citados en "Boom, et al.; US5234809EP0389063y sus patentes familiares".
    • B. Vogelstein y D. Gillespie; " Purificación preparativa y analítica de ADN a partir de agarosa" PNAS 1979, vol.  76, n.º  2, págs.  615-619 .
  3. ↑ Según el método original de Boom, preferiblemente etanol al 70% para limitar las pérdidas de rendimiento.
  4. ↑ Los procedimientos de estimación de orden para la estimación son los siguientes.
    • El radio de cada partícula (r) es aproximadamente
    0,5 μm=0,511061001dometro=0,5×10−4dometro{\displaystyle =0.5{\frac {1}{10^{6}}}{\frac {100}{1}}cm=0.5\times 10^{-4}cm}.
    • Por lo tanto, el volumen de cada partícula (V) es aproximadamente 5,2*10 −13 cm 3 por
    V=2×23πr3=43πr3{\displaystyle V=2\times {\frac {2}{3}}\pi r^{3}={\frac {4}{3}}\pi {r}^{3}}.
    • Cuando suponemos que la partícula magnética es Fe 3 O 4 entonces, la densidad (D) 5,17 g/cm 3 .
    • Entonces, el peso (w) de cada partícula es aproximadamente
    w=VD=2,7 págs.

Referencias

  1. 1 2 3 4 5 6 Boom, et al.; US5234809EP0389063y sus patentes familiares.
  2. 1 2 3 4 R Boom, CJ Sol, MM Salimans, CL Jansen, PM Wertheim-van Dillen y J van der Noordaa; "Método rápido y sencillo para la purificación de ácidos nucleicos." J. Clin. Microbiol. Marzo de 1990 vol. 28 n.º 3 495-503
  3. ^ Matti Korpela ;​ ​US6468810
  4. 1 2 3 4 5 Notas técnicas dela marca Bio-Nobile
  5. ↑ Por John Brunstein; "Métodos de extracción de muestras: cómo obtenemos ADN y ARN" Archivado el 21/10/2014 en Wayback Machine.
  6. 1 2 https://www.hanc.info/labs/labresources/procedures/ACTGIMPAACT%20Lab%20Manual/Standard%20Roche%20Monitor%20Test,%20Boom%20Extraction.pdf
  7. 1 2 Guido Hennig; Christoph Petry; Ellen Sampson. "La automatización del aislamiento de ácidos nucleicos para uso in vitro proporciona un rendimiento mejorado de los ensayos en el laboratorio de diagnóstico molecular" (PDF) . Siemens.
  8. ↑ ¿Cómo funcionan las perlas SPRI?
  9. ↑ "Métodos de extracción de ADN para grandes volúmenes de sangre" . Archivado del original el 15 de octubre de 2008. Consultado el 12 de abril de 2013 .
  10. ↑ B Vogelstein y D Gillespie; "Purificación preparativa y analítica de ADN a partir de agarosa" PNAS 1979 vol. 76 n.º 2 pp. 615-619
  11. ↑ "US5342931" .
  12. ↑ "US5973138" .
  13. ↑ "Purificación y aislamiento de ADN mediante partículas magnéticas" .
  14. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hideji Tajima;US5702950, US6331277, EE. UU. 2001/0007770 A1y sus patentes familiares. Véase tambiénEnlace obsoleto archivado el 11/04/2013 en archive.today .
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  16. 1 2 "Dispositivo y método para la separación de micropartículas magnéticas" .
  17. 1 2 "Aparatos y métodos para la separación magnética que emplean medios magnéticos externos" .
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