Hispanopedia WikiUna biblioteca de ADNc es una combinación de fragmentos de ADNc ( ADN complementario ) clonados e insertados en una colección de células huésped, que constituyen una parte del transcriptoma del organismo y se almacenan como una " biblioteca ". El ADNc se produce a partir de ARNm completamente transcrito que se encuentra en el núcleo y, por lo tanto, contiene solo los genes expresados de un organismo. De manera similar, se pueden producir bibliotecas de ADNc específicas de tejido. En las células eucariotas , el ARNm maduro ya está empalmado ; por lo tanto, el ADNc producido carece de intrones y puede expresarse fácilmente en una célula bacteriana. [ 1 ] Si bien la información en las bibliotecas de ADNc es una herramienta poderosa y útil, ya que los productos génicos se identifican fácilmente, las bibliotecas carecen de información sobre potenciadores , intrones y otros elementos reguladores que se encuentran en una biblioteca de ADN genómico . [ 2 ]
Construcción de una biblioteca de ADNc
El ADNc se crea a partir de un ARNm maduro de una célula eucariota mediante la transcriptasa inversa . En los eucariotas, una cola de poli(A) (que consiste en una larga secuencia de nucleótidos de adenina) distingue al ARNm del ARNt y del ARNr , y por lo tanto puede usarse como sitio de cebador para la transcripción inversa. Esto presenta el problema de que no todos los transcritos, como los de la histona , codifican una cola de poli(A) . [ 3 ] [ 4 ]
Extracción de ARNm
En primer lugar, es necesario aislar la plantilla de ARNm para la creación de bibliotecas de ADNc. Dado que el ARNm solo contiene exones, se debe considerar la integridad del ARNm aislado para que la proteína codificada aún pueda producirse. El ARNm aislado debe tener un tamaño de entre 500 pb y 8 kb. [ 5 ] Existen varios métodos para purificar ARN, como la extracción con Trizol y la purificación en columna . La purificación en columna se puede realizar utilizando resinas recubiertas con nucleótidos de dT oligoméricos, y se pueden aprovechar características del ARNm, como tener una cola de poli-A, de modo que solo se unirán las secuencias de ARNm que contengan dicha característica. El ARNm deseado unido a la columna se eluye posteriormente .
construcción de ADNc
Una vez purificado el ARNm, un cebador oligo-dT (una secuencia corta de nucleótidos de desoxitimidina) se une a la cola poli-A del ARN. El cebador es necesario para iniciar la síntesis de ADN por la enzima transcriptasa inversa . Esto da como resultado la creación de híbridos ARN-ADN donde una sola hebra de ADN complementario se une a una hebra de ARNm. [ 6 ] Para eliminar el ARNm, se utiliza la enzima ARNasa H para escindir el esqueleto del ARNm y generar grupos 3'-OH libres, lo cual es importante para el reemplazo del ARNm por ADN. [ 5 ] Luego se agrega la ADN polimerasa I, el ARN escindido actúa como un cebador que la ADN polimerasa I puede identificar e iniciar el reemplazo de los nucleótidos de ARN por los de ADN. [ 5 ] Esto lo proporciona el propio sscADN al enrollarse sobre sí mismo en el extremo 3', generando un bucle en horquilla . La polimerasa extiende el extremo 3'-OH, y posteriormente el bucle en el extremo 3' se abre mediante la acción de tijera de la nucleasa S 1. A continuación , se utilizan endonucleasas de restricción y ADN ligasa para clonar las secuencias en plásmidos bacterianos .
Posteriormente, se seleccionan las bacterias clonadas, generalmente mediante selección con antibióticos. Una vez seleccionadas, se crean cepas que luego se cultivan y secuencian para compilar la biblioteca de ADNc.
La biblioteca de ADNc utiliza
Las bibliotecas de ADNc se utilizan comúnmente para reproducir genomas eucariotas, ya que la cantidad de información se reduce al eliminar las numerosas regiones no codificantes. También se utilizan para expresar genes eucariotas en procariotas. Los procariotas no tienen intrones en su ADN y, por lo tanto, carecen de enzimas que puedan eliminarlos durante la transcripción. El ADNc, al no tener intrones, puede expresarse en células procariotas. Las bibliotecas de ADNc son especialmente útiles en genética inversa , donde la información genómica adicional resulta menos relevante. Además, se emplean con frecuencia en clonación funcional para identificar genes en función de la función de la proteína codificada. Al estudiar el ADN eucariota, se construyen bibliotecas de expresión utilizando ADN complementario (ADNc) para asegurar que el inserto sea realmente un gen. [ 6 ]
Biblioteca de ADNc frente a biblioteca de ADN genómico
Las bibliotecas de ADNc carecen de los elementos no codificantes y reguladores presentes en el ADN genómico. Las bibliotecas de ADN genómico proporcionan información más detallada sobre el organismo, pero su generación y mantenimiento requieren más recursos.
Clonación de ADNc
Las moléculas de ADNc se pueden clonar utilizando enlazadores con sitios de restricción. Los enlazadores son fragmentos cortos de ADN de doble cadena ( oligodesoxirribonucleótidos ) de aproximadamente 8 a 12 pares de nucleótidos de longitud que incluyen un sitio de corte para una endonucleasa de restricción, por ejemplo, BamHI. Tanto el ADNc como el enlazador tienen extremos romos, que se pueden ligar utilizando una alta concentración de ADN ligasa T4. Posteriormente, se generan extremos cohesivos en la molécula de ADNc mediante el corte de los extremos del ADNc (que ahora contienen enlazadores con un sitio incorporado) con la endonucleasa adecuada. A continuación, también se corta un vector de clonación ( plásmido ) con la endonucleasa adecuada. Tras la ligación de los extremos cohesivos del inserto en el vector, la molécula de ADN recombinante resultante se transfiere a una célula huésped de E. coli para su clonación.
Véase también
Referencias
- ↑ Ying, Shao-Yao (2003). Generación de bibliotecas de ADNc: métodos y protocolos . Métodos en biología molecular. Totowa, NJ: Humana Press. ISBN 978-1-58829-066-3.
- ↑ "Descripción general y aplicaciones de la biblioteca de ADNc - Creative Biogene" . www.creative-biogene.com . Consultado el 17 de octubre de 2024 .
- ↑ Biblioteca de ADNc || ¿Cómo se construye una biblioteca de ADNc? || ¿Para qué se utilizan las bibliotecas de ADN? , 27 de agosto de 2019 , consultado el 19 de febrero de 2024
- ↑ Tamang, Sanju (30 de junio de 2024). "Biblioteca de ADN (genómica, ADNc): tipos, preparación, usos" . microbenotes.com . Consultado el 17 de octubre de 2024 .
- 1 2 3 Ying, Shao-Yao (2004). "Bibliotecas de ADN complementario: una visión general". Biotecnología molecular . 27 (3): 245– 252. doi : 10.1385/MB:27:3:245 . PMID 15247497 .
- 1 2 P., Clark, David (2009). Biotecnología : aplicación de la revolución genética . Pazdernik, Nanette Jean. Ámsterdam: Academic Press/Elsevier. ISBN 9780121755522OCLC 226038060
{{cite book}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
Enlaces externos
- Base de datos de anotación funcional del ratón ( FANTOM )
- Ejemplos de síntesis y clonación de ADNc
- Preparación de bibliotecas de ADNc para el análisis de secuenciación de ARN de alto rendimiento de los extremos 5′ del ARN.
- Biología molecular
- ADN