Purificación de ácidos nucleicos mediante columnas de centrifugación

La purificación de ácidos nucleicos mediante columnas de centrifugación es un método de extracción en fase sólida para purificar rápidamente ácidos nucleicos . Este método se basa en el hecho de que el ácido nucleico se une a la fase sólida de sílice bajo ciertas condiciones.

Las distintas etapas del método son lisis, unión, lavado y elución. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Más específicamente, esto implica la lisis de las células objetivo para liberar los ácidos nucleicos , la unión selectiva del ácido nucleico a una membrana de sílice, el lavado de partículas e inhibidores que no están unidos a la membrana de sílice y la elución del ácido nucleico, con el resultado final de ácido nucleico purificado en una solución acuosa.

Para la lisis, las células (sangre, tejido, etc.) de la muestra deben someterse a un tratamiento que rompa la membrana celular y libere el ácido nucleico. Dependiendo del material objetivo, esto puede incluir el uso de detergente u otros tampones, proteinasas u otras enzimas, calentamiento a diferentes tiempos/temperaturas o disrupción mecánica, como cortar con un cuchillo o un homogeneizador , usar un mortero y una mano de mortero, o moler con perlas.

Para la unión, se añade una solución tampón a la muestra lisada junto con etanol o isopropanol . La muestra en la solución de unión se transfiere a una columna de centrifugación , que se coloca en una centrífuga o se conecta a un sistema de vacío. La centrífuga/sistema de vacío fuerza la solución a través de una membrana de sílice dentro de la columna, donde, bajo las condiciones iónicas adecuadas, los ácidos nucleicos se unen a la membrana de sílice mientras el resto de la solución la atraviesa. Una vez unido el material objetivo, se puede eliminar el flujo.

Para el lavado, se añade un nuevo tampón a la columna y se centrifuga/aspira a través de la membrana. Este tampón tiene como objetivo mantener las condiciones de unión, eliminando las sales de unión y otros contaminantes restantes. Generalmente se requieren varios lavados, a menudo con porcentajes crecientes de etanol/isopropanol, hasta que el ácido nucleico en la membrana de sílice esté libre de contaminantes. El último lavado suele ser en seco para permitir la evaporación del alcohol, dejando únicamente los ácidos nucleicos purificados unidos a la columna.

Finalmente, la elución consiste en añadir una solución acuosa a la columna, lo que permite que el ácido nucleico hidrofílico salga de ella y vuelva a la solución. Este paso puede optimizarse mediante la adición de sal, ajustando el pH, el tiempo o aplicando calor. Por último, para capturar el eluido/eluente, la columna se transfiere a un microtubo limpio antes de la última centrifugación.

Incluso antes de los métodos de ácidos nucleicos empleados hoy en día, se sabía que, en presencia de agentes caotrópicos , como el yoduro de sodio o el perclorato de sodio , el ADN se une a la sílice, a partículas de vidrio o a algas unicelulares llamadas diatomeas , que recubren sus paredes celulares con sílice . Esta propiedad se utilizó para purificar ácidos nucleicos mediante polvo de vidrio o perlas de sílice en condiciones alcalinas. ^{[ 3 ]} Posteriormente, este método se mejoró utilizando tiocianato de guanidinio o hidrocloruro de guanidinio como agente caotrópico. ^{[ 4 ]} Para facilitar su manipulación, el uso de perlas de vidrio se sustituyó posteriormente por columnas de sílice. Y para permitir el uso de instrumentos de extracción automatizados, se desarrollaron perlas paramagnéticas recubiertas de sílice , más conocidas como extracción con "perlas magnéticas".

• Separación de ADN mediante adsorción de sílice
• Extracción con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo
• Precipitación con etanol
• Purificación de ADN SCODA
• Preparación de plásmidos