MAGIChip

Los MAGIChips , también conocidos como " microarrays de compuestos inmovilizados en gel sobre un chip " o " microarrays de ADN tridimensionales ", son dispositivos para hibridación molecular que se fabrican inmovilizando oligonucleótidos , ADN , enzimas , anticuerpos y otros compuestos sobre una micromatriz fotopolimerizada de almohadillas de gel de poliacrilamida de 100x100x20  μm o de menor tamaño. Esta tecnología se utiliza para el análisis de la hibridación de ácidos nucleicos , la unión específica de ADN y compuestos de bajo peso molecular con proteínas, y las interacciones proteína-proteína.

Las almohadillas de gel aumentan la superficie de hibridación hasta 50 veces, en comparación con los microarrays típicos que se imprimen en la superficie plana de un portaobjetos de vidrio, el cual generalmente se trata con compuestos químicos a los que se adhieren las sondas. Se puede lograr una densidad de sonda de más de 10¹² moléculas por almohadilla de gel debido a la naturaleza tridimensional de las mismas. El microarray se basa en una superficie de vidrio con pequeñas unidades de gel de poliacrilamida adheridas. Cada unidad de gel funciona como una celda de reacción individual, ya que está rodeada por una superficie de vidrio hidrofóbica que impide la mezcla de la solución en las unidades de gel. Esto sienta las bases para realizar ligación , extensión de una sola base, amplificación de ADN por PCR , espectrometría de masas MALDI-TOF en chip y otras reacciones.

La tecnología MAGIChip se desarrolló gracias a la colaboración entre el Dr. David Stahl de la Universidad de Washington y el Dr. Andrei Mirzabekov, anteriormente del Laboratorio Nacional Argonne. Andrei Mirzabekov inició en 1988 el desarrollo de la secuenciación de ADN mediante hibridación con oligonucleótidos: un método innovador. Este método sentó las bases de la biotecnología que utiliza microchips biológicos para identificar rápidamente estructuras de ADN, lo cual es de gran importancia en la lucha contra diversas enfermedades.

En 1998 se anunció un proyecto de investigación conjunto entre Motorola Inc., Packard Instrument Company y el Laboratorio Nacional Argonne del Departamento de Energía de Estados Unidos. En 1999, los investigadores del Laboratorio Nacional Argonne impulsaron el desarrollo de una tecnología de biochips tipo microarray que habían codiseñado con el Instituto Engelhardt para prevenir un brote mundial de tuberculosis.

Motorola desarrolló procesos de fabricación para la producción en masa de biochips, y Packard desarrolló y fabricó los instrumentos analíticos para procesar y analizar dichos biochips. La contribución de Argonne, en colaboración con el Instituto Engelhardt de Biología Molecular (EIMB) , consistió en propiedad intelectual en forma de 19 invenciones relacionadas con microchips biológicos.

Sin embargo, esta colaboración entre el EIMB de Moscú, el Laboratorio Nacional Argonne de Illinois y otros dos socios comerciales estadounidenses fracasó en 2001 debido a una disputa sobre los términos contractuales. Como consecuencia de este conflicto, el Dr. Andrei Mirzabekov dimitió como director del Centro de Tecnología de Biochips de Argonne.

Se crean matrices de elementos de gel (almohadillas) sobre la superficie de vidrio (micromatriz), seguidas de la aplicación e inmovilización química de diferentes compuestos (sondas) sobre estas almohadillas de gel. A continuación, se añade la muestra de prueba a esta micromatriz que contiene las sondas inmovilizadas en las almohadillas de gel, y se permiten reacciones de reconocimiento molecular bajo condiciones específicas. La muestra de prueba se marca con fluorescencia para monitorizar las interacciones moleculares. El análisis de los patrones de interacción molecular se realiza mediante un software especializado.

La matriz de elementos de gel sobre un portaobjetos de vidrio se prepara mediante fotopolimerización. La solución de acrilamida que se va a polimerizar se aplica a la cámara de polimerización . Esta cámara consta de una máscara de cuarzo, dos espaciadores de teflón y un portaobjetos de vidrio microscópico, sujetos mediante dos pinzas metálicas. La cara interna de la máscara de cuarzo presenta ventanas transparentes a la luz ultravioleta (UV) dispuestas espacialmente de forma específica en una película de cromo opaca. La cámara, que contiene el gel de acrilamida, se expone a la luz UV para permitir la polimerización únicamente en las posiciones de la cámara situadas directamente debajo de las ventanas transparentes.

Los oligonucleótidos o fragmentos de ADN deben activarse para contener grupos químicamente reactivos que faciliten su acoplamiento con los elementos del gel activado. La activación de la sonda depende de la química de activación de los geles de poliacrilamida. Por lo tanto, para inmovilizar la sonda en un gel que contiene aldehído, esta debe tener un grupo amino reactivo; si los geles se activan mediante la introducción de grupos amino, las sondas deben contener un grupo aldehído libre. Las sondas se preparan habitualmente mediante la introducción de grupos químicamente activos en la posición terminal de los oligonucleótidos durante su síntesis.

Las sondas para inmovilización se transfieren a los elementos de gel de la micromatriz mediante robots dispensadores. El pin de fibra óptica de los robots tiene una superficie lateral hidrofóbica y una punta hidrofílica, y funciona a baja temperatura para evitar la evaporación de la muestra durante la transferencia. Las sondas activadas se inmovilizan químicamente mediante el acoplamiento de oligonucleótidos con grupos amino o aldehído a soportes de gel que contienen grupos aldehído o amino, respectivamente.

Las moléculas objetivo se marcan con colorantes fluorescentes . La detección por fluorescencia permite monitorizar el proceso en tiempo real con alta resolución espacial. Los criterios para el procedimiento de marcaje incluyen:

1. Debe ser sencillo, rápido y económico.
2. Debería ser aplicable tanto a dianas de ARN como de ADN.
3. Debe ser compatible con la fragmentación necesaria para disminuir la formación de estructuras secundarias.
4. Debería permitir la incorporación de una etiqueta en un fragmento para asegurar una cuantificación adecuada de la intensidad de hibridación.
5. Debería permitir el acoplamiento de múltiples colorantes.

Reacciones de amplificación en el chip

La amplificación en chip de la reacción de hibridación resulta una herramienta muy útil cuando el ADN o la proteína en estudio están presentes en una proporción relativamente pequeña en la población molecular aplicada al chip, por ejemplo, cuando se trata de un gen de copia única o un ARNm de baja abundancia.

En un método de extensión de una sola base, ^{[ 1 ]} un cebador se hibrida con el ADN y se extiende mediante un dideoxirribonucleósido trifosfato que coincide con el nucleótido en un sitio polimórfico. Al realizar esta reacción a una temperatura superior a la de fusión del dúplex entre el ADN y la sonda inmovilizada, se permite una rápida asociación/disociación del ADN diana. De este modo, la misma molécula de ADN reacciona con muchos cebadores individuales, lo que da lugar a la amplificación de los cebadores en cada almohadilla de gel. Este procedimiento se aplicó a la identificación de la mutación del gen de la beta-globina en pacientes con beta talasemia y a la detección del gen de la toxina del ántrax.

Los chips también proporcionan una buena plataforma para realizar PCR directamente en el chip (en almohadillas de gel individuales), ya que es fácil aislar cada almohadilla de gel de su vecina, a diferencia de los chips de microarrays típicos que presentan serios problemas para realizar la misma tarea.

Para el análisis de los resultados de hibridación obtenidos con moléculas diana marcadas con fluorescencia, se emplean microscopios de fluorescencia . El instrumento está equipado con una mesa de muestras con temperatura controlada para variar la temperatura en la cámara de reacción que contiene el chip durante el experimento. Se utiliza una cámara CCD ( dispositivo de carga acoplada ) refrigerada para registrar las señales luminosas del chip, que luego se envían al programa informático para la evaluación cuantitativa de las señales de hibridación en todo el chip. Los datos generados por estos experimentos se almacenan en una base de datos y se analizan mediante un software que facilita la evaluación, la experimentación in silico y el control de calidad del hardware y el software.

• Pueden utilizarse para estudiar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en su método. Debido a que el ADN bacteriano se conserva en gran medida a lo largo del tiempo, los SNP son útiles para identificar bacterias en el chip, y dado que los SNP son las variaciones más abundantes en el genoma humano, se han convertido en los marcadores primarios para estudios genéticos de mapeo e identificación de genes susceptibles a enfermedades complejas. ^{[ 5 ]}
• Se pueden utilizar para detectar factores de virulencia, que son toxinas y proteínas que invaden el organismo. Estas toxinas suelen tener un número reducido de copias y se producen en condiciones muy específicas del huésped. En este caso, la estrategia de identificación se centra en la secuencia de ADN de copia única, donde las microarrays MAGIChips resultan muy eficaces.
• Los biochips de proteínas resultan muy interesantes, ya que las proteínas se encuentran dentro de una sola célula y pueden analizarse en una única plataforma de microarrays. Estos biochips pueden utilizarse para identificar biomarcadores proteicos para el diagnóstico de enfermedades o de una etapa específica de la enfermedad. También pueden ayudar a dilucidar la relación entre la estructura y la función de una proteína, e identificar la función de una o varias proteínas en el mismo tipo celular o en diferentes tipos celulares. Si bien los MAGIChips requieren algunas modificaciones, las aplicaciones y técnicas son bastante estándar. ^{[ 6 ]}
• Los chips pueden utilizarse como herramienta de diagnóstico en clínicas gracias a su rápida detección, alto rendimiento, fiabilidad de los resultados, identificación jerárquica y cuantificación. Con ellos, es posible reducir el tiempo necesario para la toma de muestras y la obtención de resultados en entornos clínicos a menos de dos horas. La rapidez en la entrega de resultados es una ventaja importante para las pruebas en el punto de atención, mientras el paciente espera los resultados.
• La alta capacidad de procesamiento de estos dispositivos permite analizar miles de sondas microbianas para la identificación específica de especies e incluso de cepas simultáneamente en un solo chip, reduciendo la cantidad de muestra necesaria para realizar múltiples pruebas. Las posibles amenazas que supone el uso de bacterias, virus y hongos como armas biológicas contra los seres humanos, la agricultura y el medio ambiente justifican el desarrollo de tecnología para una detección precisa y sensible en muy poco tiempo. MAGIChip es una tecnología prometedora que se ha utilizado para la discriminación de virus importantes. Se han incorporado sondas fúngicas a los chips de ARNr para la investigación agrícola en genética, reproducción, enfermedades e incluso protección de cultivos. Se pueden analizar miles de genes simultáneamente para buscar diversidad genética o infestación microbiana, ya sea de origen natural o por liberación intencionada.

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