Fluoróforo

Un fluoróforo (o fluorocromo , de manera similar a un cromóforo ) es un compuesto químico fluorescente que puede volver a emitir luz al ser excitado por la luz. Los fluoróforos suelen contener varios grupos aromáticos combinados o moléculas planares o cíclicas con varios enlaces π . ^[1]

Los fluoróforos se utilizan a veces solos, como trazadores en fluidos, como colorante para la tinción de ciertas estructuras, como sustrato de enzimas o como sonda o indicador (cuando su fluorescencia se ve afectada por aspectos ambientales como la polaridad o los iones). De manera más general, se unen covalentemente a macromoléculas y sirven como marcadores (o colorantes, o etiquetas, o reporteros) para reactivos afines o bioactivos ( anticuerpos , péptidos, ácidos nucleicos). Los fluoróforos se utilizan notablemente para teñir tejidos, células o materiales en una variedad de métodos analíticos, como la obtención de imágenes fluorescentes y la espectroscopia .

La fluoresceína , a través de su derivado isotiocianato reactivo con amina , el isotiocianato de fluoresceína (FITC), ha sido uno de los fluoróforos más populares. Desde el etiquetado de anticuerpos, las aplicaciones se han extendido a los ácidos nucleicos gracias a la carboxifluoresceína . Otros fluoróforos históricamente comunes son los derivados de la rodamina (TRITC), la cumarina y la cianina . ^[2] Las generaciones más nuevas de fluoróforos, muchas de las cuales son patentadas, a menudo funcionan mejor, siendo más fotoestables, más brillantes o menos sensibles al pH que los colorantes tradicionales con excitación y emisión comparables. ^{[3] [4]}

El fluoróforo absorbe energía luminosa de una longitud de onda específica y reemite luz a una longitud de onda más larga. Las longitudes de onda absorbidas , la eficiencia de transferencia de energía y el tiempo antes de la emisión dependen tanto de la estructura del fluoróforo como de su entorno químico, ya que la molécula en su estado excitado interactúa con las moléculas circundantes. Las longitudes de onda de máxima absorción (≈ excitación) y emisión (por ejemplo, Absorción/Emisión = 485 nm/517 nm) son los términos típicos utilizados para referirse a un fluoróforo determinado, pero puede ser importante considerar todo el espectro. El espectro de longitud de onda de excitación puede ser una banda muy estrecha o más amplia, o puede estar todo más allá de un nivel de corte. El espectro de emisión suele ser más nítido que el espectro de excitación, y es de una longitud de onda más larga y, en consecuencia, de menor energía. Las energías de excitación varían desde el ultravioleta hasta el espectro visible , y las energías de emisión pueden continuar desde la luz visible hasta la región del infrarrojo cercano .

Las principales características de los fluoróforos son:

• Longitud de onda máxima de excitación y emisión (expresada en nanómetros (nm)): corresponde al pico en los espectros de excitación y emisión (normalmente un pico cada uno).
• Coeficiente de absorción molar (en mol ⁻¹ cm ⁻¹ ): vincula la cantidad de luz absorbida, en una longitud de onda dada, con la concentración de fluoróforo en solución.
• Rendimiento cuántico : eficiencia de la energía transferida de la luz incidente a la fluorescencia emitida (el número de fotones emitidos por fotones absorbidos).
• Tiempo de vida (en picosegundos): duración del estado excitado de un fluoróforo antes de volver a su estado fundamental. Se refiere al tiempo que tarda una población de fluoróforos excitados en decaer a 1/ e (≈0,368) de la cantidad original.
• Desplazamiento de Stokes : diferencia entre las longitudes de onda de máxima excitación y máxima emisión.
• Fracción oscura : proporción de moléculas que no emiten fluorescencia. En el caso de los puntos cuánticos , la microscopía prolongada de moléculas individuales mostró que entre el 20 y el 90 % de todas las partículas nunca emiten fluorescencia. ^[5] Por otro lado, las nanopartículas de polímero conjugado (Pdots) casi no muestran fracción oscura en su fluorescencia. ^[6] Las proteínas fluorescentes pueden tener una fracción oscura debido a un plegamiento incorrecto de proteínas o a una formación defectuosa de cromóforos. ^[7]

Estas características determinan otras propiedades, como el fotoblanqueo o la fotorresistencia (pérdida de fluorescencia tras la excitación continua con luz). Se deben tener en cuenta otros parámetros, como la polaridad de la molécula de fluoróforo, el tamaño y la forma del fluoróforo (es decir, para el patrón de fluorescencia de polarización ) y otros factores que pueden cambiar el comportamiento de los fluoróforos.

Los fluoróforos también se pueden utilizar para apagar la fluorescencia de otros colorantes fluorescentes o para transmitir su fluorescencia a longitudes de onda aún más largas .

La mayoría de los fluoróforos son pequeñas moléculas orgánicas de 20 a 100 átomos (200 a 1000 Dalton ; el peso molecular puede ser mayor dependiendo de las modificaciones injertadas y las moléculas conjugadas), pero también hay fluoróforos naturales mucho más grandes que son proteínas : la proteína fluorescente verde (GFP) tiene 27 kDa , y varias ficobiliproteínas (PE, APC...) tienen ≈240 kDa. En 2020, se afirmaba que el fluoróforo más pequeño conocido era el 3-hidroxiisonicotinaldehído , un compuesto de 14 átomos y solo 123 Da. ^[8]

Las partículas fluorescentes como los puntos cuánticos (de 2 a 10 nm de diámetro y de 100 a 100 000 átomos) también se consideran fluoróforos. ^[9]

El tamaño del fluoróforo podría obstaculizar estéricamente la molécula marcada y afectar la polaridad de la fluorescencia.

Las moléculas fluoróforas pueden utilizarse solas o servir como motivo fluorescente de un sistema funcional. En función de la complejidad molecular y los métodos sintéticos, las moléculas fluoróforas pueden clasificarse en cuatro categorías: proteínas y péptidos, compuestos orgánicos pequeños, oligómeros y polímeros sintéticos y sistemas multicomponentes. ^{[10] [11]}

Las proteínas fluorescentes GFP, YFP y RFP (verde, amarilla y roja, respectivamente) se pueden unir a otras proteínas específicas para formar una proteína de fusión , sintetizada en las células después de la transfección de un portador de plásmido adecuado .

Los fluoróforos orgánicos no proteicos pertenecen a las siguientes familias químicas principales:

• Derivados del xanteno : fluoresceína , rodamina , verde de Oregón, eosina y rojo de Texas.
• Derivados de la cianina : cianina, indocarbocianina , oxacarbocianina, tiacarbocianina y merocianina
• Derivados de esquaraína y esquaraínas sustituidas en anillo , incluidos los colorantes Seta y Square
• Derivados del rotaxano escuaraína: Ver colorantes Tau
• Derivados del naftaleno ( derivados del dansilo y del prodán)
• Derivados de la cumarina
• Derivados del oxadiazol : piridiloxazol, nitrobenzoxadiazol y benzoxadiazol
• Derivados del antraceno : antraquinonas , incluidas DRAQ5, DRAQ7 y CyTRAK Orange
• Derivados del pireno : azul cascada, etc.
• Derivados de la oxazina : rojo Nilo , azul Nilo , violeta de cresilo , oxazina 170, etc.
• Derivados de la acridina : proflavina , naranja de acridina , amarillo de acridina , etc.
• Derivados de arilmetina : auramina , violeta cristal , verde malaquita
• Derivados del tetrapirrol : porfina , ftalocianina , bilirrubina
• Derivados del dipirrometano: BODIPY , aza-BODIPY

Estos fluoróforos emiten fluorescencia debido a electrones deslocalizados que pueden saltar una banda y estabilizar la energía absorbida. Por ejemplo, el benceno , uno de los hidrocarburos aromáticos más simples, se excita a 254 nm y emite a 300 nm. ^[12] Esto diferencia a los fluoróforos de los puntos cuánticos, que son nanopartículas semiconductoras fluorescentes .

Se pueden unir a las proteínas a grupos funcionales específicos, como grupos amino ( éster activo , carboxilato , isotiocianato , hidrazina ), grupos carboxilo ( carbodiimida ), tiol ( maleimida , bromuro de acetilo ) y azida orgánica (a través de química clic o de forma no específica ( glutaraldehído )).

Además, pueden estar presentes varios grupos funcionales para alterar sus propiedades, como la solubilidad, o conferir propiedades especiales, como el ácido borónico que se une a los azúcares o múltiples grupos carboxilo para unirse a ciertos cationes. Cuando el colorante contiene un grupo donador de electrones y un grupo aceptor de electrones en extremos opuestos del sistema aromático, este colorante probablemente será sensible a la polaridad del entorno ( solvatocrómico ), por lo que se lo denomina sensible al medio ambiente. A menudo, los colorantes se utilizan dentro de las células, que son impermeables a las moléculas cargadas; como resultado de esto, los grupos carboxilo se convierten en un éster, que es eliminado por esterasas dentro de las células, por ejemplo, fura-2AM y diacetato de fluoresceína.

Las siguientes familias de tintes son grupos de marcas comerciales y no necesariamente comparten similitudes estructurales.

• Colorante CF (Biotium)
• Sondas DRAQ y CyTRAK (BioStatus)
• Cuerpo ( Invitrogen )
• EverFluor (Biotecnología Setareh)
• Alexa Fluor (Invitrogen)
• Bella Fluor (Biotecnología Setareh)
• Fluoruro de DyLight (Thermo Scientific, Pierce)
• Atto y Tracy ( Sigma Aldrich )
• Sondas Fluo ( Interchim )
• Tintes Abberior (Abberior)
• Tintes DY y MegaStokes (Dyomics)
• Colorantes sulfo cy (cyandye)
• HiLyte Fluor (AnaSpec)
• Tintes Seta, SeTau y Square (SETA BioMedicals)
• Colorantes Quasar y Cal Fluor ( Biosearch Technologies )
• Tintes SureLight ( APC , RPE PerCP , ficobilisomas ) (Columbia Biosciences)
• APC, APCXL, RPE, BPE (Phyco-Biotech, Greensea, Prozyme, Flogen)
• Tintes Vio (Miltenyi Biotec)

Abreviaturas:

• Ex (nm): Longitud de onda de excitación en nanómetros
• Em (nm): Longitud de onda de emisión en nanómetros
• MW: Peso molecular
• QY: Rendimiento cuántico

StayGold y mStayGold son proteínas fluorescentes avanzadas que han contribuido significativamente al campo de la obtención de imágenes de células vivas. StayGold, conocida por su alta fotoestabilidad y brillo, fue diseñada originalmente como una proteína fluorescente dimérica, que, si bien era efectiva, planteaba desafíos relacionados con la agregación y la precisión del etiquetado. ^[15] Para abordar estas limitaciones, mStayGold fue diseñada como una variante monomérica, lo que mejora su utilidad en el etiquetado preciso de proteínas. mStayGold exhibe una fotoestabilidad superior, mantiene la fluorescencia en condiciones de alta irradiancia y demuestra un mayor brillo en comparación con su variante anterior StayGold. Además, madura más rápido, lo que permite una obtención de imágenes más rápida después de la transfección. Estos avances hacen de mStayGold una herramienta versátil para una variedad de aplicaciones, incluido el seguimiento de moléculas individuales y la obtención de imágenes de alta resolución de procesos celulares dinámicos, lo que amplía las capacidades de la proteína fluorescente en la investigación biológica. ^[16]

Abreviaturas:

• Ex (nm): Longitud de onda de excitación en nanómetros
• Em (nm): Longitud de onda de emisión en nanómetros
• MW: Peso molecular
• QY: Rendimiento cuántico
• BR: Brillo: Coeficiente de absorción molar * rendimiento cuántico / 1000
• PS: Fotoestabilidad : tiempo [seg] para reducir el brillo al 50%

Los fluoróforos tienen particular importancia en el campo de la bioquímica y los estudios de proteínas , por ejemplo, en inmunofluorescencia , análisis de células, ^[17] inmunohistoquímica , ^{[3] [18]} y sensores de moléculas pequeñas . ^{[19] [20]}

Los colorantes fluorescentes encuentran un amplio uso en la industria, recibiendo el nombre de "colores neón", como por ejemplo:

• Usos a escala de varias toneladas en el teñido de textiles y blanqueadores ópticos en detergentes para ropa
• Formulaciones cosméticas avanzadas
• Equipo y ropa de seguridad
• Diodos orgánicos emisores de luz (OLED)
• Bellas artes y diseño (carteles y pinturas)
• Sinergistas para insecticidas y fármacos experimentales
• Tintes en iluminadores para dar un efecto brillante.
• Paneles solares para captar más luz/longitudes de onda
• El tinte marino fluorescente se utiliza para ayudar a los equipos de búsqueda y rescate aéreos a localizar objetos en el agua.

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• Fluorescencia en las ciencias de la vida
• Extinción de la fluorescencia
• Recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP): una aplicación para cuantificar la movilidad de moléculas en bicapas lipídicas .

• La base de datos de colorantes fluorescentes
• Tabla de fluorocromos
• El Manual de Sondas Moleculares: un recurso integral sobre la tecnología de fluorescencia y sus aplicaciones.