Técnicas de análisis de microarrays

La comparación de dos matrices diferentes o dos muestras diferentes hibridadas a la misma matriz generalmente implica realizar ajustes para los errores sistemáticos introducidos por las diferencias en los procedimientos y los efectos de la intensidad del tinte. La normalización del tinte para matrices de dos colores a menudo se logra mediante regresión local . LIMMA proporciona un conjunto de herramientas para la corrección del fondo y el escalado, así como una opción para promediar puntos duplicados en la diapositiva. ^{[ 5 ]} Un método común para evaluar qué tan bien normalizada está una matriz es graficar un gráfico MA de los datos. Los gráficos MA se pueden producir utilizando programas y lenguajes como R y MATLAB. ^{[ 6 ] [ 7 ]}

Los datos brutos de Affy contienen alrededor de veinte sondas para el mismo ARN diana. La mitad de estas son "puntos de desajuste", que no coinciden exactamente con la secuencia diana. Teóricamente, estos pueden medir la cantidad de unión no específica para una diana dada. El promedio robusto de múltiples matrices (RMA) ^{[ 8 ]} es un enfoque de normalización que no aprovecha estos puntos de desajuste, pero aún debe resumir las coincidencias perfectas a través del pulido de mediana . ^{[ 9 ]} El algoritmo de pulido de mediana, aunque robusto, se comporta de manera diferente según el número de muestras analizadas. ^{[ 10 ]} La normalización de cuantiles , también parte de RMA, es un enfoque sensato para normalizar un lote de matrices para que las comparaciones posteriores sean significativas.

El algoritmo actual Affymetrix MAS5, que utiliza sondas tanto de coincidencia perfecta como de no coincidencia, sigue gozando de popularidad y obteniendo buenos resultados en pruebas comparativas. ^{[ 11 ]}

El análisis factorial para la síntesis robusta de microarrays (FARMS) ^{[ 12 ]} es una técnica basada en modelos para resumir datos de microarrays a nivel de sonda de coincidencia perfecta. Se basa en un modelo de análisis factorial para el cual un método bayesiano de máxima probabilidad a posteriori optimiza los parámetros del modelo bajo el supuesto de ruido de medición gaussiano. Según el benchmark de Affycomp ^{[ 13 ],} FARMS superó a todos los demás métodos de síntesis con respecto a la sensibilidad y la especificidad .

Existen muchas estrategias para identificar sondas de microarrays que muestran un nivel inusual de sobreexpresión o subexpresión. La más sencilla consiste en considerar "significativa" cualquier sonda que difiera en un promedio de al menos el doble entre los grupos de tratamiento. Los enfoques más sofisticados suelen estar relacionados con pruebas t u otros mecanismos que tienen en cuenta tanto el tamaño del efecto como la variabilidad. Curiosamente, los valores p asociados a genes particulares no se reproducen bien entre experimentos replicados, y las listas generadas por el cambio de pliegue directo funcionan mucho mejor. ^{[ 14 ] [ 15 ]} Esto representa una observación extremadamente importante, ya que el objetivo de realizar experimentos radica en predecir el comportamiento general. El grupo MAQC recomienda utilizar una evaluación del cambio de pliegue más un umbral de valor p no estricto , señalando además que los cambios en la corrección del fondo y el proceso de escalado tienen un impacto mínimo en el orden de clasificación de las diferencias de cambio de pliegue, pero un impacto sustancial en los valores p. ^{[ 14 ]}

El clustering es una técnica de minería de datos que se utiliza para agrupar genes con patrones de expresión similares. El clustering jerárquico y el clustering k-means son técnicas ampliamente utilizadas en el análisis de microarrays.

Los sistemas comerciales para el análisis de redes genéticas, como Ingenuity ^{[ 21 ]} y Pathway Studio ^{[ 22 ],} crean representaciones visuales de genes con expresión diferencial basadas en la literatura científica actual. Herramientas no comerciales como FunRich ^{[ 23 ]} , GenMAPP y Moksiskaan también ayudan a organizar y visualizar datos de redes genéticas obtenidos de uno o varios experimentos de microarrays. Una amplia variedad de herramientas de análisis de microarrays están disponibles a través de Bioconductor , escritas en el lenguaje de programación R. El módulo SAM, citado con frecuencia, y otras herramientas de microarrays ^{[ 24 ]} están disponibles a través de la Universidad de Stanford. Otro conjunto está disponible en Harvard y el MIT ^{[ 25 ] .}

También se han desarrollado herramientas de software especializadas para el análisis estadístico que determinan el grado de sobreexpresión o subexpresión de un gen en un experimento de microarray en relación con un estado de referencia, para ayudar a identificar genes o conjuntos de genes asociados con fenotipos particulares . Un método de análisis de este tipo, conocido como Análisis de Enriquecimiento de Conjuntos de Genes (GSEA), utiliza una estadística de estilo Kolmogorov-Smirnov para identificar grupos de genes que se regulan juntos. ^{[ 1 ]} Este paquete estadístico de terceros ofrece al usuario información sobre los genes o conjuntos de genes de interés, incluidos enlaces a entradas en bases de datos como GenBank del NCBI y bases de datos curadas como Biocarta ^{[ 26 ]} y Gene Ontology . La herramienta de análisis de enriquecimiento de complejos proteicos (COMPLEAT) proporciona un análisis de enriquecimiento similar a nivel de complejos proteicos. ^{[ 27 ]} La herramienta puede identificar la regulación dinámica de complejos proteicos bajo diferentes condiciones o puntos de tiempo. Sistemas relacionados, PAINT ^{[ 28 ]} y SCOPE ^{[ 29 ]} realizan un análisis estadístico en regiones promotoras de genes, identificando la sobrerrepresentación y subrepresentación de elementos de respuesta de factores de transcripción previamente identificados . Otra herramienta de análisis estadístico es Rank Sum Statistics for Gene Set Collections (RssGsc), que utiliza funciones de distribución de probabilidad de suma de rangos para encontrar conjuntos de genes que expliquen datos experimentales. ^{[ 30 ]} Un enfoque adicional es el metaanálisis contextual , es decir, descubrir cómo un grupo de genes responde a una variedad de contextos experimentales. Genevestigator es una herramienta pública para realizar metaanálisis contextual en contextos tales como partes anatómicas, etapas de desarrollo y respuesta a enfermedades, sustancias químicas, estrés y neoplasias .

• Realizar experimentos de microarrays : microarrays de ADN con oligonucleótidos y cebadores de ADNc, microarrays de SNP, microarrays de proteínas, etc. Esto permite un análisis de alto rendimiento de la expresión génica, la variación genética o las interacciones proteína-proteína.
• Análisis de expresiones de entrada en Microsoft Excel: véase a continuación.
• Ejecuta SAM como un complemento de Microsoft Excel.
• Ajuste el parámetro de ajuste Delta para obtener un número significativo de genes junto con una tasa de descubrimiento falso (FDR) aceptable y evalúe el tamaño de la muestra calculando la diferencia media en la expresión en el controlador de gráficos SAM.
• Lista de genes con expresión diferencial (genes con expresión positiva y negativa)

• SAM está disponible para su descarga en línea en http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/ para usuarios académicos y no académicos después de completar un paso de registro.
• SAM se ejecuta como un complemento de Excel, y el controlador de gráficos de SAM permite personalizar la tasa de falsos descubrimientos y el delta, mientras que la funcionalidad de gráficos y salida de SAM genera una lista de genes significativos, una tabla delta y una evaluación de los tamaños de muestra.
• Las permutaciones se calculan en función del número de muestras.
• Permutaciones de bloques
  • Los bloques son lotes de microarrays; por ejemplo, para ocho muestras divididas en dos grupos (control y afectado) hay 4!=24 permutaciones para cada bloque y el número total de permutaciones es (24)(24)= 576. Se recomienda un mínimo de 1000 permutaciones; ^{[ 32 ] [ 36 ] [ 37 ]}

El usuario establece el número de permutaciones al introducir los valores correctos para el conjunto de datos que se va a ejecutar en SAM.

SAM calcula un estadístico de prueba para la diferencia relativa en la expresión génica basado en el análisis de permutación de datos de expresión y calcula una tasa de falsos descubrimientos. Los cálculos principales del programa se ilustran a continuación. ^{[ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]}

La constante s _o se elige para minimizar el coeficiente de variación de d _i . r _i es igual a los niveles de expresión (x) para el gen i bajo y condiciones experimentales.

${\displaystyle \mathrm {Tasa de descubrimiento falso (FDR)={\frac {Mediana (o percentil 90) del número de genes llamados falsamente}{Número de genes llamados significativos}}} }$

Los cambios de expresión (t) se especifican para garantizar que los genes considerados significativos presenten un cambio mínimo predefinido. Esto significa que el valor absoluto de los niveles de expresión promedio de un gen bajo cada una de las dos condiciones debe ser mayor que el cambio de expresión (t) para que se considere positivo, y menor que el inverso del cambio de expresión (t) para que se considere negativo.

El algoritmo SAM se puede expresar de la siguiente manera:

1. Ordenar las estadísticas de prueba según su magnitud ^{[ 33 ] [ 34 ]}
2. Para cada permutación, calcule las puntuaciones nulas (no afectadas) ordenadas ^{[ 33 ] [ 34 ]}
3. Grafique el estadístico de prueba ordenado frente a las puntuaciones nulas esperadas ^{[ 33 ] [ 34 ]}
4. Se considera que cada gen es significativo si el valor absoluto del estadístico de prueba para ese gen menos la media del estadístico de prueba para ese gen es mayor que un umbral establecido ^{[ 34 ].}
5. Estimar la tasa de falsos descubrimientos en función de los valores esperados frente a los observados ^{[ 33 ] [ 34 ]}

• Los datos de matrices de oligonucleótidos o ADNc, matrices de SNP, matrices de proteínas, etc., pueden utilizarse en SAM ^{[ 33 ] [ 34 ].}
• Correlaciona los datos de expresión con los parámetros clínicos ^{[ 35 ]}
• Correlaciona los datos de expresión con el tiempo ^{[ 32 ]}
• Utiliza la permutación de datos para estimar la tasa de falsos descubrimientos para pruebas múltiples ^{[ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 38 ]}
• Informa la tasa de falsos descubrimientos locales (la FDR para genes que tienen un d _i similar al de ese gen) ^{[ 32 ]} y las tasas de omisión ^{[ 32 ] [ 33 ]}
• Puede funcionar con un diseño de bloques para cuando los tratamientos se aplican dentro de diferentes lotes de matrices ^{[ 32 ].}
• Se puede ajustar el umbral que determina el número de genes considerados significativos ^{[ 32 ]}

Es posible que algunos conjuntos de datos presenten defectos evidentes detectables mediante inspección visual, comparaciones por pares con conjuntos del mismo grupo experimental o análisis de la degradación del ARN. ^{[ 39 ]} Los resultados podrían mejorar si se excluyeran estos conjuntos de datos del análisis por completo.

Dependiendo del tipo de matriz, se puede restar la señal relacionada con la unión inespecífica del fluoróforo para obtener mejores resultados. Un método consiste en restar la intensidad de señal promedio del área entre los puntos. Hay varias herramientas disponibles para la corrección del fondo y análisis adicionales de TIGR, ^{[ 40 ]} Agilent ( GeneSpring ), ^{[ 41 ]} y Ocimum Bio Solutions (Genowiz). ^{[ 42 ]}

La identificación visual de defectos locales, como imprimción o lavado, también puede sugerir la eliminación de puntos individuales. Esto puede llevar bastante tiempo, dependiendo de la calidad de fabricación de la matriz. Además, algunos procedimientos requieren la eliminación de todos los puntos con un valor de expresión inferior a un determinado umbral de intensidad.