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Microscopio

Un microscopio es un instrumento de laboratorio que se utiliza para examinar objetos demasiado pequeños para ser vistos a simple vista . La microscopía es la ciencia que estudia...

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Un microscopio es un instrumento de laboratorio que se utiliza para examinar objetos demasiado pequeños para ser vistos a simple vista . La microscopía es la ciencia que estudia objetos y estructuras diminutas mediante un microscopio. Microscópico significa invisible a simple vista, a menos que se utilice un microscopio.

Existen muchos tipos de microscopios, y se pueden agrupar de diferentes maneras. Una forma es describir el método que utiliza un instrumento para interactuar con una muestra y producir imágenes, ya sea enviando un haz de luz o electrones a través o sobre una muestra en su trayectoria óptica , detectando emisiones de fotones de una muestra, o escaneando a través y a corta distancia de la superficie de una muestra utilizando una sonda. [ 1 ] [ 2 ] El microscopio más común (y el primero en ser inventado) es el microscopio óptico , que utiliza lentes para refractar la luz visible que pasa a través de una muestra delgadamente seccionada o para refractar la luz reflejada desde la superficie de un objeto para producir una imagen observable. Otros tipos importantes de microscopios son el microscopio de fluorescencia , el microscopio electrónico (tanto el microscopio electrónico de transmisión como el microscopio electrónico de barrido ) y varios tipos de microscopios de sonda de barrido . [ 3 ]

Historia

Microscopios del siglo XVIII del Musée des Arts et Métiers , París

Aunque los objetos que se asemejan a lentes datan de hace 4000 años y hay relatos griegos de las propiedades ópticas de esferas llenas de agua (siglo V a. C.) seguidos de muchos siglos de escritos sobre óptica, el uso más antiguo conocido de microscopios simples ( lupas ) se remonta al uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII. [ 1 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] Los primeros ejemplos conocidos de microscopios compuestos, que combinan una lente objetivo cerca de la muestra con un ocular para ver una imagen real , aparecieron en Europa alrededor de 1620. [ 8 ] El inventor es desconocido, aunque se han hecho muchas afirmaciones a lo largo de los años. Varias giran en torno a los centros de fabricación de anteojos en los Países Bajos , incluyendo afirmaciones de que fue inventado en 1590 por Zacharias Janssen (afirmación hecha por su hijo) o el padre de Zacharias, Hans Martens, o ambos; [ 9 ] [ 10 ] afirma que fue inventado por su vecino y rival fabricante de gafas, Hans Lippershey (quien solicitó la primera patente de telescopio en 1608); [ 11 ] y afirma que fue inventado por el expatriado Cornelis Drebbel , de quien se sabe que tenía una versión en Londres en 1619. [ 12 ] [ 13 ] Galileo Galilei (también citado a veces como inventor del microscopio compuesto) parece haber descubierto después de 1610 que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños y, después de ver un microscopio compuesto construido por Drebbel exhibido en Roma en 1624, construyó su propia versión mejorada. [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] Giovanni Faber , en una carta a Federico Cesi , acuñó el nombre microscopio [ 17 ] para el microscopio compuesto que Galileo presentó a la Accademia dei Lincei en 1625 [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] (Galileo lo había llamado occhiolino 'ojo pequeño'). [ 20 ] René Descartes ( Dioptrique, 1637) describe microscopios en los que se utiliza un espejo cóncavo, con su concavidad hacia el objeto, junto con una lente, para iluminar el objeto, que está montado en un punto que lo fija en el foco del espejo. [ 21 ]

El auge de los microscopios ópticos modernos

Un microscopio de sobremesa creado por Joseph Gutteridge en la década de 1860, que forma parte de la colección de la Galería de Arte y Museo Herbert.

La primera descripción detallada de la anatomía microscópica del tejido orgánico basada en el uso de un microscopio no apareció hasta 1644, en L'occhio della mosca , o El ojo de la mosca , de Giambattista Odierna . [ 22 ]

El microscopio seguía siendo en gran medida una novedad hasta las décadas de 1660 y 1670, cuando los naturalistas de Italia, los Países Bajos e Inglaterra comenzaron a utilizarlo para estudiar biología. El científico italiano Marcello Malpighi , considerado por algunos historiadores de la biología como el padre de la histología , inició su análisis de estructuras biológicas con los pulmones. La publicación en 1665 de la Micrographia de Robert Hooke tuvo un gran impacto, principalmente debido a sus impresionantes ilustraciones. Hooke creó diminutas lentes de pequeños glóbulos de vidrio mediante la fusión de los extremos de hilos de vidrio hilado. [ 21 ] Una contribución significativa provino de Antonie van Leeuwenhoek [ 7 ] , quien logró una magnificación de hasta 300 veces utilizando un microscopio simple de una sola lente. Colocó una lente esférica de vidrio muy pequeña entre los orificios de dos placas metálicas remachadas, y con una aguja ajustable mediante tornillos para montar la muestra. [ 23 ] Luego, Van Leeuwenhoek redescubrió los glóbulos rojos (después de Jan Swammerdam ) y los espermatozoides , y ayudó a popularizar el uso de microscopios para observar la microestructura biológica. El 9 de octubre de 1676, van Leeuwenhoek informó del descubrimiento de microorganismos. [ 24 ]

Microscopio binocular compuesto Carl Zeiss, 1914

El rendimiento de un microscopio óptico compuesto depende de la calidad y el uso correcto del sistema de lentes condensadoras para enfocar la luz sobre la muestra y de la lente objetivo para capturar la luz de la muestra y formar una imagen. [ 8 ] Los primeros instrumentos eran limitados hasta que este principio se comprendió y desarrolló plenamente desde finales del siglo XIX hasta principios del XX, y hasta que las lámparas eléctricas estuvieron disponibles como fuentes de luz. En 1893, August Köhler desarrolló un principio clave de iluminación de muestras, la iluminación de Köhler , que es fundamental para alcanzar los límites teóricos de resolución del microscopio óptico. Este método de iluminación de muestras produce una iluminación uniforme y supera el contraste y la resolución limitados impuestos por las primeras técnicas de iluminación de muestras. Otros avances en la iluminación de muestras surgieron del descubrimiento del contraste de fase por Frits Zernike en 1953, y de la iluminación de contraste de interferencia diferencial por Georges Nomarski en 1955; ambos permiten la obtención de imágenes de muestras transparentes sin teñir.

microscopios electrónicos

Microscopio electrónico construido por Ernst Ruska en 1933.

A principios del siglo XX se desarrolló una alternativa significativa al microscopio óptico: un instrumento que utiliza un haz de electrones en lugar de luz para generar imágenes. El físico alemán Ernst Ruska , junto con el ingeniero eléctrico Max Knoll , desarrolló el primer prototipo de microscopio electrónico en 1931: un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Este microscopio funciona con principios similares a los de un microscopio óptico, pero utiliza electrones en lugar de luz y electroimanes en lugar de lentes de vidrio. El uso de electrones, en lugar de luz, permite una resolución mucho mayor.

El desarrollo del microscopio electrónico de transmisión fue seguido rápidamente en 1935 por el desarrollo del microscopio electrónico de barrido por Max Knoll . [ 25 ] Aunque los TEM se utilizaban para la investigación antes de la Segunda Guerra Mundial y se popularizaron después, el SEM no estuvo disponible comercialmente hasta 1965.

Los microscopios electrónicos de transmisión se popularizaron tras la Segunda Guerra Mundial . Ernst Ruska, que trabajaba en Siemens , desarrolló el primer microscopio electrónico de transmisión comercial y, en la década de 1950, comenzaron a celebrarse importantes congresos científicos sobre microscopía electrónica. En 1965, el profesor Sir Charles Oatley y su estudiante de posgrado Gary Stewart desarrollaron el primer microscopio electrónico de barrido comercial , comercializado por la Cambridge Instrument Company con el nombre de "Stereoscan".

Uno de los descubrimientos más recientes sobre el uso del microscopio electrónico es la capacidad de identificar un virus. [ 26 ] Dado que este microscopio produce una imagen visible y clara de pequeños orgánulos, en un microscopio electrónico no se necesitan reactivos para ver el virus o las células dañinas, lo que resulta en una forma más eficiente de detectar patógenos.

Microscopios de sonda de barrido

Primer microscopio de fuerza atómica

Entre 1981 y 1983, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer trabajaron en IBM en Zúrich , Suiza, para estudiar el fenómeno del efecto túnel cuántico . Crearon un instrumento práctico, un microscopio de sonda de barrido basado en la teoría del efecto túnel cuántico, que medía fuerzas muy pequeñas intercambiadas entre una sonda y la superficie de una muestra. La sonda se acerca tanto a la superficie que los electrones pueden fluir continuamente entre la sonda y la muestra, generando una corriente desde la superficie hasta la sonda. El microscopio no tuvo una buena acogida inicialmente debido a la complejidad de las explicaciones teóricas subyacentes. En 1984, Jerry Tersoff y el Dr. Hamann, mientras trabajaban en los Laboratorios Bell de AT&T en Murray Hill, Nueva Jersey, comenzaron a publicar artículos que vinculaban la teoría con los resultados experimentales obtenidos por el instrumento. A esto le siguió de cerca en 1985 la aparición de instrumentos comerciales funcionales, y en 1986 la invención del microscopio de fuerza atómica por Gerd Binnig, Quate y Gerber , y posteriormente el Premio Nobel de Física de Binnig y Rohrer por el microscopio de sonda de barrido (SPM). [ 27 ]

Se han seguido desarrollando nuevos tipos de microscopios de sonda de barrido a medida que ha avanzado la capacidad de mecanizar sondas y puntas ultrafinas.

microscopios de fluorescencia

Microscopio de fluorescencia con torreta de cubos de filtro sobre las lentes objetivo, acoplado a una cámara.

Los desarrollos más recientes en microscopía óptica se centran principalmente en el auge de la microscopía de fluorescencia en biología . [ 28 ] Durante las últimas décadas del siglo XX, particularmente en la era postgenómica , se desarrollaron muchas técnicas para la tinción fluorescente de estructuras celulares . [ 28 ] Los principales grupos de técnicas incluyen la tinción química dirigida de estructuras celulares específicas, por ejemplo, el compuesto químico DAPI para marcar el ADN , el uso de anticuerpos conjugados a reporteros fluorescentes, véase inmunofluorescencia , y proteínas fluorescentes, como la proteína verde fluorescente . [ 29 ] Estas técnicas utilizan estos diferentes fluoróforos para el análisis de la estructura celular a nivel molecular tanto en muestras vivas como fijas.

El auge de la microscopía de fluorescencia impulsó el desarrollo de un importante diseño de microscopio moderno: el microscopio confocal . El principio fue patentado en 1957 por Marvin Minsky , aunque la tecnología láser limitó la aplicación práctica de la técnica. No fue hasta 1978 cuando Thomas y Christoph Cremer desarrollaron el primer microscopio confocal de barrido láser práctico , y la técnica rápidamente ganó popularidad durante la década de 1980.

microscopios de superresolución

Gran parte de la investigación actual (a principios del siglo XXI) sobre técnicas de microscopía óptica se centra en el desarrollo del análisis de superresolución de muestras marcadas con fluorescencia. La iluminación estructurada puede mejorar la resolución entre dos y cuatro veces, y técnicas como la microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED) se aproximan a la resolución de los microscopios electrónicos. [ 30 ] Esto se debe a que el límite de difracción se produce por la luz o la excitación, lo que hace que la resolución deba duplicarse para alcanzar la supersaturación. Stefan Hell recibió el Premio Nobel de Química de 2014 por el desarrollo de la técnica STED, junto con Eric Betzig y William Moerner, quienes adaptaron la microscopía de fluorescencia para la visualización de moléculas individuales. [ 31 ]

microscopios de rayos X

Los microscopios de rayos X son instrumentos que utilizan radiación electromagnética, generalmente en la banda de rayos X blandos, para obtener imágenes de objetos. Los avances tecnológicos en la óptica de lentes de rayos X a principios de la década de 1970 convirtieron al instrumento en una opción viable para la obtención de imágenes. [ 32 ] Se utilizan frecuentemente en tomografía (véase microtomografía computarizada ) para producir imágenes tridimensionales de objetos, incluidos materiales biológicos que no han sido fijados químicamente. Actualmente se están realizando investigaciones para mejorar la óptica para rayos X duros, que tienen mayor poder de penetración. [ 32 ]

Tipos

Tipos de microscopios ilustrados mediante los principios de sus trayectorias de haz.
Evolución de la resolución espacial lograda con microscopios ópticos, de transmisión (TEM) y electrónicos con corrección de aberraciones (ACTEM) [ 33 ]

Los microscopios se pueden clasificar en varias categorías. Una de ellas se basa en el método que interactúa con la muestra para generar la imagen: luz o fotones (microscopios ópticos), electrones (microscopios electrónicos) o una sonda (microscopios de sonda de barrido). Otra clasificación se basa en si analizan la muestra mediante un punto de barrido (microscopios ópticos confocales, microscopios electrónicos de barrido y microscopios de sonda de barrido) o si la analizan de forma continua (microscopios ópticos de campo amplio y microscopios electrónicos de transmisión).

Los microscopios ópticos de campo amplio y los microscopios electrónicos de transmisión utilizan la teoría de las lentes ( óptica para microscopios ópticos y lentes electromagnéticas para microscopios electrónicos) para magnificar la imagen generada por el paso de una onda transmitida a través de la muestra o reflejada por ella. Las ondas utilizadas son electromagnéticas (en microscopios ópticos ) o haces de electrones (en microscopios electrónicos ). La resolución en estos microscopios está limitada por la longitud de onda de la radiación utilizada para obtener la imagen de la muestra; longitudes de onda más cortas permiten una mayor resolución. [ 28 ]

Los microscopios ópticos y electrónicos de barrido, como el microscopio confocal y el microscopio electrónico de barrido, utilizan lentes para enfocar un punto de luz o electrones sobre la muestra y luego analizan las señales generadas por la interacción del haz con la muestra. El punto se desplaza sobre la muestra para analizar una región rectangular. La ampliación de la imagen se logra mostrando los datos del escaneo de un área de muestra físicamente pequeña en una pantalla relativamente grande. Estos microscopios tienen el mismo límite de resolución que los microscopios ópticos, de sonda y electrónicos de campo amplio.

Los microscopios de sonda de barrido también analizan un único punto de la muestra y luego recorren con la sonda una región rectangular de la misma para generar una imagen. Dado que estos microscopios no utilizan radiación electromagnética ni electrónica para la formación de imágenes, no están sujetos al mismo límite de resolución que los microscopios ópticos y electrónicos descritos anteriormente.

Microscopio óptico

El tipo de microscopio más común (y el primero en inventarse) es el microscopio óptico . Este es un instrumento óptico que contiene una o más lentes que producen una imagen ampliada de una muestra colocada en el plano focal. Los microscopios ópticos tienen vidrio refractivo (ocasionalmente plástico o cuarzo ) para enfocar la luz en el ojo o en otro detector de luz. Los microscopios ópticos basados ​​en espejos funcionan de la misma manera. La magnificación típica de un microscopio óptico, suponiendo luz en el rango visible, es de hasta 1250× con un límite de resolución teórica de alrededor de 0,250 micrómetros o 250 nanómetros . [ 28 ] Esto limita la magnificación práctica a ~1500×. Las técnicas especializadas (por ejemplo, microscopía confocal de barrido , Vertico SMI ) pueden superar esta magnificación, pero la resolución está limitada por la difracción . El uso de longitudes de onda de luz más cortas, como la ultravioleta, es una forma de mejorar la resolución espacial del microscopio óptico, al igual que dispositivos como el microscopio óptico de barrido de campo cercano .  

La técnica de Sarfus es una técnica óptica reciente que aumenta la sensibilidad de un microscopio óptico estándar hasta el punto de permitir la visualización directa de películas nanométricas (de hasta 0,3  nanómetros) y nanoobjetos aislados (de hasta 2  nm de diámetro). Esta técnica se basa en el uso de sustratos no reflectantes para la microscopía de luz reflejada con polarización cruzada.

La luz ultravioleta permite visualizar características microscópicas y obtener imágenes de muestras transparentes al ojo humano. La luz infrarroja cercana se puede utilizar para visualizar circuitos integrados en dispositivos de silicio unidos, ya que el silicio es transparente en este rango de longitudes de onda.

En la microscopía de fluorescencia se pueden utilizar muchas longitudes de onda de luz, desde el ultravioleta hasta el visible, para hacer que las muestras fluorescan , lo que permite observarlas a simple vista o con cámaras especialmente sensibles.

Células sin teñir vistas mediante microscopía de campo claro (izquierda) en comparación con la microscopía de contraste de fase (derecha).

La microscopía de contraste de fase es una técnica de iluminación microscópica óptica en la que pequeños cambios de fase en la luz que atraviesa una muestra transparente se convierten en cambios de amplitud o contraste en la imagen. [ 28 ] El uso del contraste de fase no requiere tinción para visualizar la muestra. Esta técnica microscópica permitió estudiar el ciclo celular en células vivas.

El microscopio óptico tradicional ha evolucionado recientemente hacia el microscopio digital . Además de, o en lugar de, observar directamente el objeto a través de los oculares , se utiliza un tipo de sensor similar a los de una cámara digital para obtener una imagen, que luego se muestra en un monitor de computadora. Estos sensores pueden usar tecnología CMOS o de dispositivo de carga acoplada (CCD), según la aplicación.

La microscopía digital con niveles de luz muy bajos para evitar daños a muestras biológicas vulnerables está disponible mediante cámaras digitales sensibles de conteo de fotones . Se ha demostrado que una fuente de luz que proporciona pares de fotones entrelazados puede minimizar el riesgo de daño a las muestras más sensibles a la luz. En esta aplicación de la imagen fantasma a la microscopía de baja emisión de fotones, la muestra se ilumina con fotones infrarrojos, cada uno de los cuales está correlacionado espacialmente con un compañero entrelazado en la banda visible para una obtención de imágenes eficiente mediante una cámara de conteo de fotones. [ 34 ]

Microscopio electrónico de transmisión moderno

Microscopio electrónico

Micrografía electrónica de transmisión de una célula en división que está experimentando citocinesis.

Los dos tipos principales de microscopios electrónicos son los microscopios electrónicos de transmisión (TEM) y los microscopios electrónicos de barrido (SEM). [ 28 ] [ 29 ] Ambos tienen una serie de lentes electromagnéticas y electrostáticas para enfocar un haz de electrones de alta energía sobre una muestra. En un TEM, los electrones pasan a través de la muestra, de forma análoga a la microscopía óptica básica . [ 28 ] Esto requiere una preparación cuidadosa de la muestra, ya que los electrones se dispersan fuertemente por la mayoría de los materiales. [ 29 ] Las muestras también deben ser muy delgadas (por debajo de 100  nm) para que los electrones las atraviesen. [ 28 ] [ 29 ] Las secciones transversales de células teñidas con osmio y metales pesados ​​revelan membranas de orgánulos claras y proteínas como los ribosomas. [ 29 ] Con un  nivel de resolución de 0,1 nm, se pueden obtener vistas detalladas de virus (20-300  nm) y una hebra de ADN (2  nm de ancho). [ 29 ] En contraste, el SEM tiene bobinas de barrido para escanear la superficie de objetos masivos con un haz de electrones fino. Por lo tanto, no es necesario seccionar las muestras, pero puede ser necesario recubrirlas con una capa nanométrica de metal o carbono para muestras no conductoras. [ 28 ] El SEM permite la obtención rápida de imágenes de la superficie de las muestras, posiblemente en vapor de agua delgado para evitar el secado. [ 28 ] [ 29 ]

Sonda de exploración

Los distintos tipos de microscopios de sonda de barrido surgen de los diversos tipos de interacciones que se producen cuando una pequeña sonda se desplaza e interactúa con una muestra. Estas interacciones o modos pueden registrarse o mapearse en función de la ubicación en la superficie para formar un mapa de caracterización. Los tres tipos más comunes de microscopios de sonda de barrido son los microscopios de fuerza atómica (AFM), los microscopios ópticos de barrido de campo cercano (NSOM o SNOM, microscopía óptica de campo cercano de barrido) y los microscopios de efecto túnel (STM). [ 35 ] Un microscopio de fuerza atómica tiene una sonda fina, generalmente de silicio o nitruro de silicio, unida a una palanca; la sonda se desplaza sobre la superficie de la muestra y se miden y mapean las fuerzas que provocan una interacción entre la sonda y la superficie de la muestra. Un microscopio óptico de barrido de campo cercano es similar a un AFM, pero su sonda consiste en una fuente de luz en una fibra óptica cubierta con una punta que suele tener una abertura para que pase la luz. El microscopio puede capturar luz transmitida o reflejada para medir propiedades ópticas muy localizadas de la superficie, comúnmente de una muestra biológica. Los microscopios de efecto túnel tienen una punta metálica con un único átomo apical; la punta está unida a un tubo por el que circula una corriente. [ 36 ] La punta se desplaza sobre la superficie de una muestra conductora hasta que circula una corriente de efecto túnel; la corriente se mantiene constante mediante el movimiento de la punta controlado por ordenador y se forma una imagen a partir de los movimientos registrados de la punta. [ 35 ]

Superficie de la hoja vista con un microscopio electrónico de barrido

Otros tipos

Los microscopios acústicos de barrido utilizan ondas sonoras para medir variaciones en la impedancia acústica. Similares en principio al sonar , se emplean para tareas como la detección de defectos en las subsuperficies de materiales, incluidos los que se encuentran en los circuitos integrados. El 4 de febrero de 2013, ingenieros australianos construyeron un "microscopio cuántico" que ofrece una precisión sin precedentes. [ 37 ]

Aplicaciones móviles

Las aplicaciones móviles con microscopio pueden utilizarse opcionalmente como microscopios ópticos al activar la linterna. Sin embargo, su uso resulta más complicado debido al ruido visual , su limitación a menudo es de 40 aumentos y las limitaciones de resolución de la propia lente de la cámara .

Véase también

Referencias

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