Microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia

La teoría óptica en la que se basa la técnica FLIC fue desarrollada por Armin Lambacher y Peter Fromherz. Ellos establecieron una relación entre la intensidad de fluorescencia observada y la distancia del fluoróforo a una superficie reflectante de silicio .

La intensidad de fluorescencia observada,${\displaystyle I_{FLIC}}$, es el producto de la probabilidad de excitación por unidad de tiempo,${\displaystyle P_{ex}}$y la probabilidad de medir un fotón emitido por unidad de tiempo,${\displaystyle P_{em}}$Ambas probabilidades son función de la altura del fluoróforo sobre la superficie de silicio, por lo que la intensidad observada también será función de la altura del fluoróforo. La disposición más simple a considerar es un fluoróforo incrustado en dióxido de silicio (índice de refracción${\displaystyle n_{1}}$) una distancia d desde una interfaz con silicio (índice de refracción)${\displaystyle n_{0}}$). El fluoróforo se excita con luz de longitud de onda${\displaystyle \lambda _{ex}}$y emite luz de longitud de onda${\displaystyle \lambda _{em}}$. El vector unitario${\displaystyle ''e_{ex}''}$indica la orientación del dipolo de transición de excitación del fluoróforo. ${\displaystyle P_{ex}}$es proporcional a la proyección al cuadrado del campo eléctrico local ,${\displaystyle F_{in}}$, que incluye los efectos de interferencia , en la dirección del dipolo de transición. ${\displaystyle P_{ex}\propto \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}$ El campo eléctrico local,${\displaystyle F_{in}}$En el fluoróforo, la interferencia entre la luz incidente directa y la luz reflejada en la superficie de silicio afecta al fluoróforo. Esta interferencia se cuantifica mediante la diferencia de fase.${\displaystyle \Phi _{in}}$dado por ${\displaystyle \Phi _{in}={\frac {4\pi n_{1}d\cos \theta _{1}^{in}}{\lambda _{ex}}}}$${\displaystyle \theta _{1}^{in}}$es el ángulo de la luz incidente con respecto a la normal del plano de silicio. La interferencia no solo modula${\displaystyle F_{in}}$, pero la superficie de silicio no refleja perfectamente la luz incidente. Los coeficientes de Fresnel dan el cambio de amplitud entre una onda incidente y una reflejada. Los coeficientes de Fresnel dependen de los ángulos de incidencia,${\displaystyle \theta _{i}}$y${\displaystyle \theta _{j}}$, los índices de refracción de los dos medios y la dirección de polarización . Los ángulos${\displaystyle \theta _{i}}$y${\displaystyle \theta _{j}}$Se pueden relacionar mediante la Ley de Snell . Las expresiones para los coeficientes de reflexión son: ${\displaystyle r_{ij}^{TE}={\frac {n_{i}\cos \theta _{i}-n_{j}\cos \theta _{j}}{n_{i}\cos \theta _{i}+n_{j}\cos \theta _{j}}}\quad r_{ij}^{TM}={\frac {n_{j}\cos \theta _{i}-n_{i}\cos \theta _{j}}{n_{j}\cos \theta _{i}+n_{i}\cos \theta _{j}}}}$ TE se refiere a la componente del campo eléctrico perpendicular al plano de incidencia y TM a la componente paralela (el plano de incidencia se define por la normal al plano y la dirección de propagación de la luz). En coordenadas cartesianas , el campo eléctrico local es ${\displaystyle F_{in}=\sin \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}0\\1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\\0\end{array}}\right]+\cos \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}\cos \theta _{1}^{in}(1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\\0\\\sin \theta _{1}^{in}(1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\end{array}}\right]}$${\displaystyle \gamma _{in}}$es el ángulo de polarización de la luz incidente con respecto al plano de incidencia. La orientación del dipolo de excitación es una función de su ángulo.${\displaystyle \theta _{ex}}$a lo normal y${\displaystyle \phi _{ex}}$azimutal al plano de incidencia. ${\displaystyle {\textit {e}}_{ex}=\left[{\begin{array}{c}\cos \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\sin \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\cos \theta _{ex}\end{array}}\right]}$ Las dos ecuaciones anteriores para${\displaystyle F_{in}}$y${\displaystyle {\textit {e}}_{ex}}$se pueden combinar para dar la probabilidad de excitar el fluoróforo por unidad de tiempo${\displaystyle P_{ex}}$Muchos de los parámetros mencionados anteriormente variarían en un experimento normal. La variación en los cinco parámetros siguientes debe incluirse en esta descripción teórica.

• La coherencia de la luz de excitación
• El ángulo de incidencia (${\displaystyle \theta _{1}^{in}}$) de luz de excitación
• Ángulo de polarización (${\displaystyle \gamma _{in}}$) de la luz de excitación
• El ángulo de transición del dipolo (${\displaystyle \theta _{ex}}$) del fluoróforo
• La longitud de onda de la luz de excitación (${\displaystyle \lambda _{ex}}$)

La proyección al cuadrado${\displaystyle \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}$Se debe promediar sobre estas cantidades para obtener la probabilidad de excitación.${\displaystyle P_{ex}}$. El promedio de los primeros 4 parámetros da como resultado ${\displaystyle <\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>\propto \int \sin \theta _{1}^{in}d\theta _{1}^{in}A_{in}(\theta _{1}^{in})\times \int \sin \theta _{ex}d\theta _{ex}O(\theta _{ex})U_{ex}(\lambda _{in},\theta _{1}^{in}.\theta _{ex})}$${\displaystyle U_{ex}=\sin ^{2}\theta _{ex}\mid 1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+\sin ^{2}\theta _{ex}\cos ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+2\cos ^{2}\theta _{ex}\sin ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}}$

Los factores de normalización no están incluidos. ${\displaystyle O(\theta _{ex})}$es una distribución del ángulo de orientación de los dipolos del fluoróforo. El ángulo azimutal${\displaystyle \phi _{ex}}$y el ángulo de polarización${\displaystyle \gamma _{in}}$se integran analíticamente, por lo que ya no aparecen en la ecuación anterior. Para obtener finalmente la probabilidad de excitación por unidad de tiempo, la ecuación anterior se integra sobre la dispersión en la longitud de onda de excitación, teniendo en cuenta la intensidad.${\displaystyle I(\lambda _{ex})}$y el coeficiente de extinción del fluoróforo${\displaystyle \epsilon (\lambda _ {ex})}$. ${\displaystyle P_{ex}\propto \int d\lambda _{ex}I(\lambda _{ex})\epsilon (\lambda _{ex})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>}$ Los pasos para calcular${\displaystyle P_{em}}$son equivalentes a los anteriores en el cálculo${\displaystyle P_{ex}}$excepto que las etiquetas de los parámetros em se reemplazan por ex y in se reemplaza por out . ${\displaystyle P_{em}\propto \int d\lambda _ {em}\Phi _ {det}(\lambda _ {em}){\textit {f}}(\lambda _ {em})<\mid F_ {in}\cdot e_ {ex}\mid ^{2}>}$ La intensidad de fluorescencia resultante medida es proporcional al producto de la probabilidad de excitación y la probabilidad de emisión.

${\displaystyle I_{FLIC}\propto P_{ex}P_{em}}$ Es importante señalar que esta teoría determina una relación de proporcionalidad entre la intensidad de fluorescencia medida.${\displaystyle I_{FLIC}}$y la distancia del fluoróforo por encima de la superficie reflectante. El hecho de que no sea una relación de igualdad tendrá un efecto significativo en el procedimiento experimental.

El análisis básico implica ajustar los datos de intensidad con el modelo teórico que permite la distancia del fluoróforo por encima de la superficie del óxido (${\displaystyle d_{\textit {f}}}$) para ser un parámetro libre . Las curvas FLIC se desplazan hacia la izquierda a medida que aumenta la distancia del fluoróforo sobre el óxido. ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$Por lo general, es el parámetro de interés, pero a menudo se incluyen otros parámetros libres para optimizar el ajuste. Normalmente se incluyen un factor de amplitud (a) y un término aditivo constante para el fondo (b). El factor de amplitud escala la intensidad relativa del modelo y el fondo constante desplaza la curva hacia arriba o hacia abajo para tener en cuenta la fluorescencia proveniente de áreas fuera de foco, como la parte superior de una célula. En ocasiones, se permite que la apertura numérica (NA) del microscopio sea un parámetro libre en el ajuste. Los demás parámetros que intervienen en la teoría óptica, como los diferentes índices de refracción, los espesores de las capas y las longitudes de onda de la luz, se consideran constantes con cierta incertidumbre. Un chip FLIC puede estar hecho con terrazas de óxido de 9 o 16 alturas diferentes dispuestas en bloques. Después de capturar una imagen de fluorescencia, cada bloque de 9 o 16 terrazas produce una curva FLIC separada que define una única${\displaystyle d_{\textit {f}}}$El promedio${\displaystyle d_{\textit {f}}}$se encuentra compilando todos los${\displaystyle d_{\textit {f}}}$valores en un histograma . El error estadístico en el cálculo de${\displaystyle d_{\textit {f}}}$El error sistemático proviene de dos fuentes: el error en el ajuste de la teoría óptica a los datos y la incertidumbre en el espesor de la capa de óxido. El error sistemático proviene de tres fuentes: la medición del espesor del óxido (generalmente mediante elipsómetro), la medición de la intensidad de fluorescencia con el CCD y la incertidumbre en los parámetros utilizados en la teoría óptica. Se ha estimado que el error sistemático es${\displaystyle \sim 1nm}$.