Procesamiento de imágenes microscópicas

El procesamiento de imágenes microscópicas es un término amplio que abarca el uso de técnicas de procesamiento digital de imágenes para procesar, analizar y presentar imágenes obtenidas con un microscopio . Este procesamiento es habitual en diversos campos, como la medicina , la investigación biológica , la investigación oncológica , las pruebas de fármacos , la metalurgia , etc. Muchos fabricantes de microscopios incorporan en sus diseños funciones específicas que permiten la conexión de los microscopios a un sistema de procesamiento de imágenes.

Hasta principios de la década de 1990, la mayoría de las capturas de imágenes en aplicaciones de microscopía de vídeo se realizaban con cámaras de vídeo analógicas, a menudo simples cámaras de circuito cerrado de televisión. Si bien esto requería el uso de un digitalizador de imágenes , las cámaras de vídeo proporcionaban imágenes a la velocidad de fotogramas completa (25-30 fotogramas por segundo), lo que permitía la grabación y el procesamiento de vídeo en directo. Aunque la llegada de los detectores de estado sólido aportó varias ventajas, la cámara de vídeo en tiempo real resultó ser superior en muchos aspectos.

Actualmente, la adquisición de datos se realiza generalmente mediante una cámara CCD montada en la trayectoria óptica del microscopio. La cámara puede ser a color o monocromática. Con frecuencia, se emplean cámaras de muy alta resolución para obtener la mayor cantidad de información directa posible. ^{[ 1 ]} El enfriamiento criogénico también es común para minimizar el ruido. A menudo, las cámaras digitales utilizadas para esta aplicación proporcionan datos de intensidad de píxeles con una resolución de 12 a 16 bits, mucho mayor que la que se utiliza en los productos de imagen de consumo.

En los últimos años, se ha invertido mucho esfuerzo en la adquisición de datos a velocidades de vídeo o superiores (25-30 fotogramas por segundo o más). Lo que antes era fácil de hacer con cámaras de vídeo convencionales, ahora requiere componentes electrónicos especiales de alta velocidad para gestionar el enorme ancho de banda de datos digitales.

La adquisición a mayor velocidad permite observar procesos dinámicos en tiempo real o almacenarlos para su posterior reproducción y análisis. Combinado con la alta resolución de imagen, este método puede generar grandes cantidades de datos brutos, cuyo procesamiento puede resultar complejo incluso para un sistema informático moderno .

Si bien los detectores CCD actuales permiten una resolución de imagen muy alta , esto suele implicar una desventaja, ya que, para un tamaño de chip dado, a medida que aumenta el número de píxeles, disminuye el tamaño de estos. A medida que los píxeles se hacen más pequeños, su profundidad de pozo disminuye, reduciendo la cantidad de electrones que se pueden almacenar. Esto, a su vez, resulta en una peor relación señal-ruido .

Para obtener los mejores resultados, es fundamental seleccionar el sensor adecuado para cada aplicación. Dado que las imágenes de microscopio tienen una resolución intrínseca limitada, a menudo no tiene sentido utilizar un detector ruidoso de alta resolución para la adquisición de imágenes. Un detector más sencillo, con píxeles más grandes, suele producir imágenes de mucha mayor calidad gracias a la reducción del ruido. Esto es especialmente importante en aplicaciones con poca luz, como la microscopía de fluorescencia .

Además, también hay que tener en cuenta los requisitos de resolución temporal de la aplicación. Un detector de menor resolución suele tener una tasa de adquisición significativamente mayor, lo que permite observar eventos más rápidos. Por el contrario, si el objeto observado está inmóvil, puede ser conveniente adquirir imágenes con la máxima resolución espacial posible, sin importar el tiempo necesario para obtener una sola imagen.

El procesamiento de imágenes para aplicaciones de microscopía comienza con técnicas fundamentales destinadas a reproducir con la mayor precisión posible la información contenida en la muestra microscópica. Esto puede incluir el ajuste del brillo y el contraste de la imagen, el promedio de imágenes para reducir el ruido y la corrección de las irregularidades de iluminación. Dicho procesamiento implica únicamente operaciones aritméticas básicas entre imágenes (es decir, suma, resta, multiplicación y división). La gran mayoría del procesamiento realizado en imágenes de microscopio es de esta naturaleza.

Otro tipo de operaciones 2D comunes, denominadas convolución de imágenes , se utilizan a menudo para reducir o realzar los detalles de una imagen. Estos algoritmos de "desenfoque" y "enfoque" en la mayoría de los programas funcionan modificando el valor de un píxel en función de una suma ponderada de este y los píxeles circundantes (una descripción más detallada de la convolución basada en kernel merece una entrada aparte) o modificando la función del dominio de la frecuencia de la imagen mediante la transformada de Fourier . La mayoría de las técnicas de procesamiento de imágenes se realizan en el dominio de la frecuencia.

Otras técnicas básicas bidimensionales incluyen operaciones como la rotación de imágenes, la deformación, el balance de color, etc.

En ocasiones, se emplean técnicas avanzadas con el objetivo de corregir la distorsión del recorrido óptico del microscopio, eliminando así las distorsiones y el desenfoque causados ​​por la instrumentación. Este proceso se denomina deconvolución , y se han desarrollado diversos algoritmos , algunos de gran complejidad matemática. El resultado es una imagen mucho más nítida y clara que la que se podría obtener únicamente en el dominio óptico. Se trata, por lo general, de una operación tridimensional que analiza una imagen volumétrica (es decir, imágenes tomadas en diferentes planos focales a través de la muestra) y utiliza estos datos para reconstruir una imagen tridimensional más precisa.

Otro requisito común es tomar una serie de imágenes en una posición fija, pero con diferentes profundidades focales. Dado que la mayoría de las muestras microscópicas son prácticamente transparentes y la profundidad de campo de la muestra enfocada es excepcionalmente reducida, es posible capturar imágenes "a través" de un objeto tridimensional utilizando equipos bidimensionales como los microscopios confocales . Posteriormente, un software puede reconstruir un modelo tridimensional de la muestra original, el cual puede manipularse adecuadamente. Este procesamiento transforma un instrumento bidimensional en uno tridimensional, algo que de otro modo no existiría. En los últimos tiempos, esta técnica ha propiciado numerosos descubrimientos científicos en biología celular.

El análisis de imágenes varía considerablemente según la aplicación. Un análisis típico incluye determinar los bordes de un objeto, contar objetos similares, calcular el área, el perímetro y otras medidas útiles de cada objeto. Un método común consiste en crear una máscara de imagen que incluya únicamente los píxeles que cumplen ciertos criterios, para luego realizar operaciones de escaneo más sencillas sobre la máscara resultante. También es posible etiquetar objetos y rastrear su movimiento a lo largo de una serie de fotogramas en una secuencia de vídeo.

• Procesamiento de imágenes

Russ, John C. (19 de diciembre de 2006) [1992]. Manual de procesamiento de imágenes (5.ª  ed.). CRC Press. ISBN 0-8493-7254-2.

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• Imágenes cuantitativas (enlace roto)