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Inmunoprecipitación de cromatina

Flujo de trabajo de secuenciación ChIP La inmunoprecipitación de cromatina ( ChIP ) es una técnica experimental de inmunoprecipitación que se utiliza para investigar la interacc...

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Flujo de trabajo de secuenciación ChIP

La inmunoprecipitación de cromatina ( ChIP ) es una técnica experimental de inmunoprecipitación que se utiliza para investigar la interacción entre proteínas y ADN en la célula. Su objetivo es determinar si proteínas específicas se asocian con regiones genómicas específicas, como factores de transcripción en promotores u otros sitios de unión al ADN , y posiblemente definir cistromas . La ChIP también busca determinar la ubicación específica en el genoma con la que se asocian diversas modificaciones de histonas , indicando el objetivo de los modificadores de histonas. [ 1 ] La ChIP es crucial para los avances en el campo de la epigenómica y para comprender mejor los fenómenos epigenéticos. [ 2 ]

En resumen, el método convencional es el siguiente:

  1. En las células o tejidos vivos , el ADN y las proteínas asociadas a la cromatina se entrecruzan (este paso se omite en la técnica Native ChIP).
  2. Posteriormente, los complejos de ADN-proteína (cromatina-proteína) se fragmentan en  trozos de ADN de aproximadamente 500 pares de bases mediante sonicación o digestión con nucleasas.
  3. Los fragmentos de ADN entrecruzados asociados a la(s) proteína(s) de interés se inmunoprecipitan selectivamente a partir de los restos celulares utilizando un anticuerpo específico para la proteína.
  4. Los fragmentos de ADN asociados se purifican y se determina su secuencia. El enriquecimiento de secuencias de ADN específicas representa regiones del genoma con las que la proteína de interés está asociada in vivo .

ChIP típico

Existen principalmente dos tipos de ChIP, que se diferencian principalmente en la preparación de la cromatina inicial. El primero utiliza cromatina reticulada reversiblemente y fragmentada mediante sonicación, denominada ChIP reticulada (XChIP). El ChIP nativo (NChIP) utiliza cromatina nativa fragmentada mediante digestión con nucleasa microcócica .

ChIP reticulado (XChIP)

La ChIP reticulada es principalmente adecuada para mapear el ADN diana de factores de transcripción u otras proteínas asociadas a la cromatina, y utiliza cromatina reticulada reversiblemente como material de partida. El agente para la reticulación reversible puede ser formaldehído [ 3 ] o luz UV . [ 4 ] Luego, la cromatina reticulada generalmente se corta por sonicación, proporcionando fragmentos de 300–1000 pares de bases (pb) de longitud. Se ha utilizado una reticulación suave con formaldehído seguida de digestión con nucleasa para cortar la cromatina. [ 5 ] Los fragmentos de cromatina de 400–500  pb han demostrado ser adecuados para ensayos de ChIP ya que cubren de dos a tres nucleosomas .

Los restos celulares en el lisado fragmentado se eliminan mediante sedimentación y los complejos proteína-ADN se inmunoprecipitan selectivamente utilizando anticuerpos específicos para la(s) proteína(s) de interés. Los anticuerpos suelen acoplarse a agarosa , sefarosa o perlas magnéticas. Alternativamente, los complejos cromatina-anticuerpo pueden retenerse y eluirse selectivamente mediante discos de polímero inerte. [ 6 ] [ 7 ] Los complejos inmunoprecipitados (es decir, el complejo perla-anticuerpo-proteína-secuencia de ADN diana) se recogen y lavan para eliminar la cromatina unida de forma no específica, se revierte el entrecruzamiento proteína-ADN y las proteínas se eliminan mediante digestión con proteinasa K. En lugar de anticuerpos para la proteína nativa de interés, se puede utilizar una versión de la proteína de interés marcada con un epítopo o biotinilación in vivo [ 8 ] .

El ADN asociado al complejo se purifica y se identifica mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), microarrays ( ChIP-on-chip ), clonación molecular y secuenciación, o secuenciación directa de alto rendimiento ( ChIP-Seq ).

ChIP nativo (NChIP)

La técnica ChIP nativa es especialmente adecuada para mapear el ADN diana de los modificadores de histonas . Generalmente, se utiliza cromatina nativa como material de partida. A medida que las histonas se enrollan alrededor del ADN para formar nucleosomas, se unen de forma natural. Posteriormente, la cromatina se fragmenta mediante digestión con nucleasa microcócica, que corta el ADN a la longitud del conector, dejando los nucleosomas intactos y generando fragmentos de ADN de entre uno (200  pb) y cinco nucleosomas (1000  pb) de longitud. A continuación, se emplean métodos similares a XChIP para eliminar los restos celulares, inmunoprecipitar la proteína de interés, separar la proteína del complejo inmunoprecipitado y purificar y analizar el ADN asociado al complejo.

Comparación de XChIP y NChIP

La principal ventaja de NChIP radica en la especificidad de los anticuerpos . La mayoría de los anticuerpos contra histonas modificadas se generan a partir de antígenos peptídicos sintéticos no fijados. Los epítopos que deben reconocer en XChIP pueden verse alterados o destruidos por la reticulación con formaldehído , especialmente porque es probable que los enlaces cruzados involucren grupos amino de lisina en los extremos N-terminales, lo que interrumpe la expresión de los epítopos. Esto probablemente explique la baja eficiencia constante de los protocolos XChIP en comparación con NChIP.

Pero XChIP y NChIP tienen objetivos y ventajas diferentes entre sí. XChIP se utiliza para mapear los sitios diana de los factores de transcripción y otras proteínas asociadas a la cromatina; NChIP se utiliza para mapear los sitios diana de los modificadores de histonas (véase la Tabla 1).

Comparación de ChIP-seq y ChIP-chip

La secuenciación por inmunoprecipitación de cromatina, también conocida como ChIP-seq , es una técnica experimental que se utiliza para identificar eventos de unión de factores de transcripción en todo el genoma . Comprender cómo interactúan las proteínas del cuerpo humano con el ADN para regular la expresión génica es fundamental para entender las enfermedades y los procesos biológicos humanos. ChIP-seq es la técnica principal para llevar a cabo esta tarea, ya que ha demostrado ser extremadamente eficaz para dilucidar cómo las proteínas y los factores de transcripción influyen en los mecanismos fenotípicos. En general, ChIP-seq se ha consolidado como un método muy eficiente para determinar estos factores, pero existe un método alternativo conocido como ChIP-on-chip.

La técnica ChIP-on-chip , también conocida como ChIP-chip, es una técnica experimental que se utiliza para aislar e identificar sitios genómicos ocupados por proteínas específicas de unión al ADN en células vivas. ChIP-on-chip es una técnica relativamente nueva, ya que fue introducida en 2001 por Peggy Farnham y Michael Zhang. Su nombre proviene de la combinación de los métodos de inmunoprecipitación de cromatina y microarrays de ADN , dando lugar a la técnica ChIP-on-chip.

Ambos métodos buscan resultados similares, ya que ambos se esfuerzan por encontrar sitios de unión de proteínas que puedan ayudar a identificar elementos en el genoma humano. Estos elementos son importantes para el avance del conocimiento sobre enfermedades y procesos biológicos humanos. La diferencia entre ChIP-seq y ChIP-chip radica en la identificación del sitio específico de unión de proteínas. La principal diferencia reside en la eficacia de ambas técnicas: ChIP-seq produce resultados con mayor sensibilidad y resolución espacial debido a su amplia cobertura genómica. Si bien ChIP-seq ha demostrado ser más eficiente que ChIP-chip, no siempre es la primera opción para los científicos. El costo y la accesibilidad de ChIP-seq constituyen una desventaja importante, lo que ha llevado al uso predominante de ChIP-chip en laboratorios de todo el mundo. [ 2 ]

Esta fotografía compara la eficacia de las dos técnicas experimentales, ChIP-seq y ChIP-chip.

Tabla 1. Ventajas y desventajas de NChIP y XChIP.

Historia y nuevos métodos de ChIP

En 1984, John T. Lis y David Gilmour, entonces estudiante de posgrado en el laboratorio de Lis, utilizaron irradiación UV, un agente de reticulación de proteínas y ácidos nucleicos de longitud cero, para reticular covalentemente proteínas unidas al ADN en células bacterianas vivas. Tras la lisis de las células reticuladas y la inmunoprecipitación de la ARN polimerasa bacteriana, el ADN asociado a la ARN polimerasa enriquecida se hibridó con sondas correspondientes a diferentes regiones de genes conocidos para determinar la distribución y densidad in vivo de la ARN polimerasa en estos genes. Un año después, utilizaron la misma metodología para estudiar la distribución de la ARN polimerasa II eucariota en genes de choque térmico de la mosca de la fruta. Estos informes se consideran los estudios pioneros en el campo de la inmunoprecipitación de cromatina. [ 9 ] [ 10 ] XChIP fue modificado y desarrollado posteriormente por Alexander Varshavsky y colaboradores, quienes examinaron la distribución de la histona H4 en genes de choque térmico utilizando reticulación con formaldehído. [ 11 ] [ 12 ] Esta técnica fue ampliamente desarrollada y perfeccionada posteriormente. [ 13 ] El enfoque NChIP fue descrito por primera vez por Hebbes et al ., 1988, [ 14 ] y también ha sido desarrollado y perfeccionado rápidamente. [ 15 ] El ensayo ChIP típico suele tardar entre 4 y 5 días y requiere al menos 10 6 ~ 10 7 células. Ahora, las nuevas técnicas de ChIP podrían lograrse con tan solo 100~1000 células y completarse en un día.

  • ChIP sin perlas : Este novedoso método ChIP utiliza discos de polímero poroso inerte funcionalizados con proteína A o G en columnas de centrifugación o microplacas. El complejo cromatina-anticuerpo se retiene selectivamente en el disco y se eluye para obtener ADN enriquecido para aplicaciones posteriores como qPCR y secuenciación. El entorno poroso está diseñado específicamente para maximizar la eficiencia de captura y reducir la unión inespecífica. Gracias a la menor manipulación manual y a los protocolos optimizados, el ChIP se puede realizar en 5 horas. [ 7 ]
  • ChIP portador (CChIP): Este método podría utilizar tan solo 100 células añadiendo células de Drosophila como cromatina portadora para reducir la pérdida y facilitar la precipitación de la cromatina diana. Sin embargo, requiere cebadores altamente específicos para la detección de la cromatina de la célula diana frente al fondo de cromatina portadora, y tarda de dos a tres días. [ 16 ]
  • ChIP rápido (qChIP): El ensayo ChIP rápido redujo el tiempo al acortar dos pasos en un ensayo ChIP típico: (i) un baño ultrasónico acelera la velocidad de unión del anticuerpo a las proteínas objetivo, y por lo tanto reduce el tiempo de inmunoprecipitación ; (ii) un procedimiento de aislamiento de ADN basado en resina (Chelex-100) reduce el tiempo de reversión de enlaces cruzados y aislamiento de ADN. Sin embargo, el protocolo rápido solo es adecuado para muestras celulares grandes (en el rango de 10⁶ a 10⁷ ) . [ 17 ] [ 18 ] Se pueden procesar hasta 24 muestras de cromatina fragmentada para obtener ADN listo para PCR en 5 horas, lo que permite sondear múltiples factores de cromatina simultáneamente y/o observar eventos genómicos en varios puntos de tiempo. [ 19 ]
  • ChIP rápido y cuantitativo (Q 2 ChIP): El ensayo utiliza 100 000 células como material de partida y es adecuado para hasta 1000 ChIP de histonas o 100 ChIP de factores de transcripción. De este modo, se pueden preparar y almacenar muchas muestras de cromatina en paralelo, y el Q 2 ChIP se puede realizar en un día. [ 20 ]
  • MicroChIP (μChIP): la cromatina se prepara generalmente a partir de 1000 células y se pueden realizar hasta 8 ensayos ChIP en paralelo sin necesidad de soportes. El ensayo también puede comenzar con 100 células, pero solo es adecuado para un único ensayo ChIP. Además, se pueden utilizar biopsias de tejido pequeñas (1 mm³ )  y el microChIP se puede realizar en un día. [ 21 ] [ 22 ]
  • Matrix ChIP : Este es un ensayo ChIP basado en microplacas con mayor rendimiento y un procedimiento simplificado. Todos los pasos se realizan en los pocillos de la microplaca sin transferencia de muestras, lo que permite su automatización. Permite realizar 96 ensayos ChIP para histonas y diversas proteínas unidas al ADN en un solo día. [ 23 ]
  • Patología-ChIP (PAT-ChIP): Esta técnica permite realizar ChIP a partir de tejidos patológicos fijados con formalina e incluidos en parafina, y por lo tanto, utilizar archivos patológicos (incluso aquellos que tienen varios años) para análisis epigenéticos y la identificación de posibles biomarcadores o dianas epigenéticas. [ 24 ]

La técnica ChIP también se ha aplicado para el análisis del genoma completo mediante su combinación con la tecnología de microarrays ( ChIP-on-chip ) o la tecnología de secuenciación de ADN de segunda generación ( Chip-Sequencing ). ChIP también puede combinarse con la secuenciación de etiquetas de extremos apareados en el análisis de interacción de cromatina mediante secuenciación de etiquetas de extremos apareados (ChIA-PET), una técnica desarrollada para el análisis a gran escala y de novo de estructuras de cromatina de orden superior. [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]

Limitaciones

  • Los ensayos a gran escala mediante ChIP presentan dificultades al utilizar organismos modelo intactos. Esto se debe a que es necesario generar anticuerpos para cada factor de transcripción (FT) o, alternativamente, producir organismos modelo transgénicos que expresen FT con etiquetas de epítopo.
  • Los investigadores que estudian los patrones de expresión genética diferencial en organismos pequeños también se enfrentan a problemas, ya que los genes se expresan a niveles bajos, en un número reducido de células y en un breve período de tiempo.
  • Los experimentos ChIP no pueden discriminar entre diferentes isoformas de TF ( isoforma de proteína ).

Véase también

  • ChIP-exo , una técnica que añade un tratamiento con exonucleasa al proceso ChIP para obtener una resolución de hasta un par de bases de los sitios de unión.
  • ChIP-on-chip combina ChIP con tecnología de microarrays.
  • DamID , una técnica alternativa de mapeo de localización que no requiere anticuerpos específicos.
  • RIP-Chip , una técnica similar para analizar las interacciones ARN-proteína.

Referencias

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  • Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en cromatina no fijada de células y tejidos para analizar modificaciones de histonas.
  • Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de complejos proteicos: mapeo de dianas genómicas de proteínas nucleares en células cultivadas
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