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Epigenómica

La epigenómica es el estudio del conjunto completo de modificaciones epigenéticas en el material genético de una célula, conocido como epigenoma . Este campo es análogo a la gen...

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La epigenómica es el estudio del conjunto completo de modificaciones epigenéticas en el material genético de una célula, conocido como epigenoma . Este campo es análogo a la genómica y la proteómica , que son el estudio del genoma y el proteoma de una célula. [ 1 ] [ 2 ] Las modificaciones epigenéticas son modificaciones reversibles en el ADN o las histonas de una célula que afectan la expresión génica sin alterar la secuencia de ADN. [ 3 ] El mantenimiento epigenómico es un proceso continuo y juega un papel importante en la estabilidad de los genomas eucariotas al participar en mecanismos biológicos cruciales como la reparación del ADN. [ 4 ] [ 5 ] Se dice que las flavonas vegetales inhiben las marcas epigenómicas que causan cáncer. [ 6 ] Dos de las modificaciones epigenéticas más caracterizadas son la metilación del ADN y la modificación de las histonas . Las modificaciones epigenéticas juegan un papel importante en la expresión y regulación génica, y están involucradas en numerosos procesos celulares como la diferenciación/desarrollo [ 7 ] y la tumorigénesis . [ 8 ] El estudio de la epigenética a nivel global solo ha sido posible recientemente gracias a la adaptación de ensayos genómicos de alto rendimiento. [ 9 ] [ 7 ]

Epigenética

Las modificaciones genómicas que alteran la expresión génica y que no pueden atribuirse a la modificación de la secuencia primaria del ADN, y que son heredables mitótica y meióticamente, se clasifican como modificaciones epigenéticas. La metilación del ADN y la modificación de las histonas se encuentran entre los procesos epigenéticos mejor caracterizados. [ 3 ]

metilación del ADN

La primera modificación epigenética que se caracterizó en profundidad fue la metilación del ADN. Como su nombre lo indica, la metilación del ADN es el proceso mediante el cual se agrega un grupo metilo al ADN. Las enzimas responsables de catalizar esta reacción son las ADN metiltransferasas (DNMT) . Si bien la metilación del ADN es estable y heredable, puede revertirse mediante un grupo de enzimas antagónicas conocidas como ADN desmetilasas. En eucariotas, la metilación se encuentra con mayor frecuencia en la posición del carbono 5 de los residuos de citosina (5mC) adyacentes a la guanina , denominados dinucleótidos CpG . [ 9 ] [ 10 ]

Los patrones de metilación del ADN varían enormemente entre especies e incluso dentro del mismo organismo. El uso de la metilación entre los animales es bastante diferente; los vertebrados presentan los niveles más altos de 5mC y los invertebrados niveles más moderados. En algunos organismos, como Caenorhabditis elegans, no se ha demostrado la presencia de 5mC ni de una ADN metiltransferasa convencional; esto sugiere que intervienen otros mecanismos además de la metilación del ADN. [ 11 ]

Dentro de un organismo, los niveles de metilación del ADN también pueden variar a lo largo del desarrollo y según la región. Por ejemplo, en las células germinales primordiales del ratón , incluso se produce una desmetilación en todo el genoma; en la etapa de implantación, los niveles de metilación vuelven a sus valores somáticos previos. [ 11 ] Cuando la metilación del ADN ocurre en las regiones promotoras , los sitios de inicio de la transcripción, tiene el efecto de reprimir la expresión génica. Esto contrasta con las regiones promotoras no metiladas, que están asociadas con genes que se expresan activamente. [ 9 ]

El mecanismo por el cual la metilación del ADN reprime la expresión génica es un proceso de múltiples pasos. La distinción entre residuos de citosina metilados y no metilados la llevan a cabo proteínas específicas de unión al ADN. La unión de estas proteínas recluta a las enzimas histona deacetilasas (HDAC) , que inician la remodelación de la cromatina , de modo que el ADN se vuelve menos accesible a la maquinaria transcripcional, como la ARN polimerasa , reprimiendo así la expresión génica. [ 12 ]

Modificación de histonas

En los eucariotas , el ADN genómico se enrolla en complejos de proteína-ADN llamados cromatina . Las histonas , que son el tipo de proteína más abundante en la cromatina, condensan el ADN; la carga positiva neta de las histonas facilita su unión con el ADN, que tiene carga negativa. Las unidades básicas y repetitivas de la cromatina, los nucleosomas , consisten en un octámero de proteínas histonas ( H2A , H2B , H3 y H4 ) y un segmento de ADN de 146 pares de bases enrollado a su alrededor. Los nucleosomas y el ADN que los conecta forman una  fibra de cromatina de 10 nm de diámetro, que puede condensarse aún más. [ 13 ] [ 14 ]

El empaquetamiento de la cromatina del ADN varía según la fase del ciclo celular y la región local del ADN. [ 15 ] El grado de condensación de la cromatina se asocia con un estado transcripcional determinado. La cromatina no empaquetada o laxa es más activa transcripcionalmente que la cromatina compactada, ya que es más accesible a la maquinaria transcripcional. Al remodelar la estructura de la cromatina y modificar la densidad del empaquetamiento del ADN, se puede modular la expresión génica. [ 14 ]

La remodelación de la cromatina ocurre a través de modificaciones postraduccionales de las colas N-terminales de las proteínas histonas centrales . [ 16 ] El conjunto colectivo de modificaciones de histonas en una célula determinada se conoce como el código de histonas . Se conocen muchos tipos diferentes de modificación de histonas, incluyendo: acetilación , metilación , fosforilación , ubiquitinación , SUMOilación , ADP-ribosilación , desaminación e isomerización de prolina ; la acetilación, metilación, fosforilación y ubiquitinación se han implicado en la activación génica, mientras que la metilación, ubiquitinación, SUMOilación, desaminación e isomerización de prolina se han implicado en la represión génica. Tenga en cuenta que varios tipos de modificación, incluyendo metilación, fosforilación y ubiquitinación, pueden estar asociados con diferentes estados transcripcionales dependiendo del aminoácido específico en la histona que se modifica. Además, la región del ADN donde ocurre la modificación de histonas también puede provocar diferentes efectos; Un ejemplo es la metilación de la tercera histona central en el residuo de lisina 36 (H3K36). Cuando H3K36 se encuentra en las secciones codificantes de un gen, se asocia con la activación génica, pero ocurre lo contrario cuando se encuentra dentro de la región promotora. [ 14 ]

Las modificaciones de las histonas regulan la expresión génica mediante dos mecanismos: la interrupción del contacto entre nucleosomas y el reclutamiento de ATPasas remodeladoras de la cromatina . Un ejemplo del primer mecanismo ocurre durante la acetilación de los aminoácidos de la cola terminal de lisina , catalizada por las histona acetiltransferasas (HAT) . Las HAT forman parte de un complejo multiproteico que se recluta a la cromatina cuando los activadores se unen a los sitios de unión del ADN. La acetilación neutraliza eficazmente la carga básica de la lisina, que participaba en la estabilización de la cromatina gracias a su afinidad por el ADN con carga negativa. Por lo tanto, las histonas acetiladas favorecen la disociación de los nucleosomas, lo que permite el desenrollamiento de la cromatina. En un estado de cromatina laxa, el ADN es más accesible a la maquinaria transcripcional, activándose así la expresión. Este proceso puede revertirse mediante la eliminación de los grupos acetilo de las histonas por las desacetilasas. [ 14 ] [ 16 ]

El segundo proceso implica el reclutamiento de complejos de remodelación de la cromatina mediante la unión de moléculas activadoras a las regiones potenciadoras correspondientes. Los complejos de remodelación de nucleosomas reposicionan los nucleosomas mediante diversos mecanismos, lo que permite o impide el acceso de la maquinaria transcripcional al ADN. El complejo proteico SWI/SNF en levaduras es un ejemplo de complejo de remodelación de la cromatina que regula la expresión de muchos genes mediante la remodelación de la cromatina. [ 14 ] [ 17 ]

Relación con otros campos genómicos

La epigenómica comparte muchas similitudes con otros campos de la genómica, tanto en metodología como en su propósito abstracto. La epigenómica busca identificar y caracterizar modificaciones epigenéticas a nivel global, de forma similar al estudio del conjunto completo de ADN en genómica o el conjunto completo de proteínas en una célula en proteómica . [ 1 ] [ 2 ] La lógica detrás de realizar análisis epigenéticos a nivel global es que se pueden hacer inferencias sobre modificaciones epigenéticas, que de otro modo no serían posibles a través del análisis de loci específicos. [ 13 ] [ 1 ] Al igual que en otros campos de la genómica, la epigenómica se basa en gran medida en la bioinformática , que combina las disciplinas de biología , matemáticas e informática . [ 18 ] Sin embargo, aunque las modificaciones epigenéticas se conocían y estudiaban desde hacía décadas, es a través de estos avances en la tecnología bioinformática que han permitido análisis a escala global. Muchas técnicas actuales aún se basan en métodos más antiguos, adaptándolos a menudo a los ensayos genómicos, como se describe en la siguiente sección.

Métodos

Ensayos de modificación de histonas

Los procesos celulares de transcripción , replicación y reparación del ADN implican la interacción entre el ADN genómico y las proteínas nucleares. Se sabía que ciertas regiones de la cromatina eran extremadamente susceptibles a la digestión por la ADNasa I , que corta el ADN con baja especificidad de secuencia. Se creía que estos sitios hipersensibles eran regiones transcripcionalmente activas, como lo demuestra su asociación con la ARN polimerasa y las topoisomerasas I y II . [ 19 ]

Ahora se sabe que la sensibilidad a las regiones de ADNasa I corresponde a regiones de cromatina con una asociación débil entre el ADN y las histonas. Los sitios hipersensibles suelen representar regiones promotoras, que requieren que el ADN sea accesible para que funcione la maquinaria transcripcional de unión al ADN. [ 20 ]

ChIP-Chip y ChIP-Seq

La modificación de histonas se detectó por primera vez a nivel genómico mediante el acoplamiento de la tecnología de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) con microarrays de ADN , denominado ChIP-Chip . [ 13 ] Sin embargo, en lugar de aislar un factor de transcripción o proteína potenciadora que se une al ADN mediante inmunoprecipitación de cromatina, las proteínas de interés son las propias histonas modificadas. Primero, las histonas se unen al ADN in vivo mediante un tratamiento químico suave (p. ej., formaldehído ). A continuación, las células se lisan, lo que permite extraer y fragmentar la cromatina, ya sea por sonicación o por tratamiento con una enzima de restricción no específica (p. ej., nucleasa microcócica ). Posteriormente, se utilizan anticuerpos específicos para la modificación para inmunoprecipitar los complejos ADN-histona. [ 14 ] Tras la inmunoprecipitación, el ADN se purifica de las histonas, se amplifica mediante PCR y se marca con una etiqueta fluorescente (p. ej., Cy5, Cy3 ). El paso final consiste en la hibridación de ADN marcado, tanto ADN inmunoprecipitado como no inmunoprecipitado, sobre un microarreglo que contiene ADN genómico inmovilizado. El análisis de la intensidad relativa de la señal permite determinar los sitios de modificación de histonas. [ 21 ] [ 22 ]

La técnica ChIP-chip se utilizó ampliamente para caracterizar los patrones globales de modificación de histonas en levaduras . A partir de estos estudios, se infirió la función de las modificaciones de histonas; se observó que la activación o represión transcripcional estaba asociada con ciertas modificaciones de histonas y por región. Si bien este método resultó eficaz para cubrir casi por completo el epigenoma de la levadura, su uso en genomas más grandes, como el humano, es limitado. [ 13 ] [ 14 ]

Para estudiar las modificaciones de histonas a nivel genómico, se combinaron otros métodos de alto rendimiento con la inmunoprecipitación de cromatina, a saber: SAGE: análisis serial de la expresión génica (ChIP-SAGE), PET: secuenciación de ditags de extremos apareados ( ChIP-PET ) y, más recientemente, secuenciación de nueva generación (ChIP-Seq) . ChIP-seq sigue el mismo protocolo que la inmunoprecipitación de cromatina, pero en lugar de amplificar el ADN purificado e hibridar con un microchip, los fragmentos de ADN se secuencian directamente mediante resecuenciación paralela de nueva generación. Ha demostrado ser un método eficaz para analizar los patrones globales de modificación de histonas y los sitios diana de proteínas, proporcionando una mayor resolución que los métodos anteriores. [ 13 ] [ 21 ]

ensayos de metilación del ADN

Las técnicas para caracterizar secuencias de ADN primarias no podían aplicarse directamente a los ensayos de metilación. Por ejemplo, cuando el ADN se amplificaba mediante PCR o técnicas de clonación bacteriana, el patrón de metilación no se copiaba y, por lo tanto, se perdía la información. La técnica de hibridación de ADN utilizada en los ensayos de ADN, en la que se empleaban sondas radiactivas para mapear e identificar secuencias de ADN, no podía utilizarse para distinguir entre ADN metilado y no metilado. [ 23 ] [ 9 ]

Métodos basados ​​en endonucleasas de restricción

Enfoques que no abarcan todo el genoma

Los primeros ensayos de detección de metilación utilizaban endonucleasas de restricción sensibles a la modificación por metilación . El ADN genómico se digirió con enzimas de restricción sensibles e insensibles a la metilación que reconocían el mismo sitio de restricción. La idea era que, cuando el sitio estaba metilado, solo la enzima insensible a la metilación podía cortar en esa posición. Al comparar los tamaños de los fragmentos de restricción generados por la enzima sensible a la metilación con los de la enzima insensible a la metilación, era posible determinar el patrón de metilación de la región. Este paso de análisis se realizó amplificando los fragmentos de restricción mediante PCR, separándolos mediante electroforesis en gel y analizándolos mediante Southern blot con sondas para la región de interés. [ 23 ] [ 9 ]

Esta técnica se utilizó para comparar los patrones de modificación de la metilación del ADN en los loci del gen de la hemoglobina humana adulta . Se sabía que diferentes regiones del gen (gamma delta beta globina) se expresaban en diferentes etapas del desarrollo. [ 24 ] De acuerdo con la función de la metilación del ADN en la represión génica, las regiones asociadas con altos niveles de metilación del ADN no se expresaban activamente. [ 25 ]

Este método era limitado y no resultaba adecuado para estudios sobre el patrón global de metilación, o «metiloma». Incluso dentro de loci específicos, no era totalmente representativo del verdadero patrón de metilación, ya que solo aquellos sitios de restricción con ensayos de restricción sensibles e insensibles a la metilación correspondientes podían proporcionar información útil. Podían surgir complicaciones adicionales cuando la digestión incompleta del ADN por las enzimas de restricción generaba resultados falsos negativos. [ 9 ]

Enfoques a nivel genómico

La caracterización a gran escala de la metilación del ADN fue posible inicialmente gracias a la técnica de escaneo genómico de marcadores de restricción (RLGS) . Al igual que el ensayo de metilación del ADN específico de locus, esta técnica identificaba el ADN metilado mediante su digestión con enzimas sensibles a la metilación. Sin embargo, fue el uso de la electroforesis bidimensional en gel lo que permitió su caracterización a mayor escala. [ 9 ]

Sin embargo, no fue hasta la llegada de la tecnología de microarrays y secuenciación de próxima generación que se hizo posible una resolución verdaderamente alta y la metilación del ADN en todo el genoma. [ 26 ] Al igual que con RLGS, el componente de endonucleasa se mantiene en el método, pero se acopla a nuevas tecnologías. Un ejemplo de este enfoque es la hibridación de metilación diferencial (DMH), en la que un conjunto de ADN genómico se digiere con enzimas de restricción sensibles a la metilación y un conjunto paralelo de ADN no se digiere. Ambos conjuntos de ADN se amplifican posteriormente y cada uno se marca con colorantes fluorescentes y se utiliza en la hibridación de matrices de dos colores. El nivel de metilación del ADN en un locus dado se determina por las proporciones de intensidad relativa de los dos colorantes. La adaptación de la secuenciación de próxima generación al ensayo de metilación del ADN proporciona varias ventajas sobre la hibridación de matrices. La tecnología basada en secuencias proporciona una mayor resolución a la metilación del ADN específica de alelos, se puede realizar en genomas más grandes y no requiere la creación de microarrays de ADN que requieren ajustes basados ​​en la densidad de CpG para funcionar correctamente. [ 9 ]

Secuenciación con bisulfito

La secuenciación con bisulfito se basa exclusivamente en la conversión química de citosinas no metiladas, de modo que puedan identificarse mediante técnicas estándar de secuenciación de ADN. El tratamiento con bisulfito de sodio y álcali logra esto al convertir los residuos de citosina no metilada en uracilo , dejando inalterada la citosina metilada. La posterior amplificación y secuenciación del ADN no tratado y del ADN tratado con bisulfito de sodio permite identificar los sitios metilados. La secuenciación con bisulfito, al igual que los métodos tradicionales basados ​​en restricción, se limitaba históricamente a los patrones de metilación de loci génicos específicos, hasta que se dispuso de tecnologías de secuenciación del genoma completo. Sin embargo, a diferencia de los métodos tradicionales basados ​​en restricción, la secuenciación con bisulfito proporciona resolución a nivel de nucleótido. [ 23 ] [ 9 ]

Las limitaciones de la técnica del bisulfito incluyen la conversión incompleta de citosina a uracilo, lo que genera falsos positivos. Además, el tratamiento con bisulfito también provoca degradación del ADN y requiere un paso de purificación adicional para eliminar el bisulfito de sodio. [ 9 ]

La secuenciación de próxima generación es muy adecuada para complementar la secuenciación con bisulfito en el análisis de metilación a nivel genómico . Si bien esto ahora permite determinar el patrón de metilación con la mayor resolución posible, a nivel de nucleótido único, aún persisten desafíos en el paso de ensamblaje debido a la complejidad de secuencia reducida en el ADN tratado con bisulfito. El aumento en la longitud de lectura busca abordar este desafío, permitiendo realizar la secuenciación de bisulfito de escopeta de genoma completo (WGBS). El enfoque WGBS utiliza una plataforma Illumina Genome Analyzer y ya se ha implementado en Arabidopsis thaliana . [ 9 ] También existen métodos genómicos de representación reducida basados ​​en la secuenciación con bisulfito, [ 27 ] [ 28 ] y son particularmente adecuados para especies con genomas de gran tamaño. [ 29 ]

Ensayos de accesibilidad de la cromatina

La accesibilidad de la cromatina es la medida de cuán "accesible" o "abierta" es una región del genoma a la transcripción o a la unión de factores de transcripción. Las regiones inaccesibles (es decir, porque están unidas a nucleosomas ) no se transcriben activamente en la célula, mientras que las regiones abiertas y accesibles sí se transcriben activamente. [ 30 ] Los cambios en la accesibilidad de la cromatina son procesos reguladores epigenéticos importantes que gobiernan la expresión génica específica de la célula o del contexto. [ 31 ] Ensayos como MNase-seq , DNase-seq , ATAC-seq o FAIRE-seq se utilizan habitualmente para comprender el panorama de la cromatina accesible de las células. La característica principal de todos estos métodos es que pueden aislar selectivamente las secuencias de ADN que están unidas a las histonas o las que no lo están. Estas secuencias se comparan luego con un genoma de referencia que permite identificar su posición relativa. [ 32 ]

MNase-seq y DNase-seq siguen los mismos principios, ya que emplean enzimas líticas que se dirigen a los ácidos nucleicos para cortar las hebras de ADN no unidas por nucleosomas u otros factores proteicos, mientras que los fragmentos unidos se protegen y pueden recuperarse y analizarse. Dado que las regiones activas no unidas se destruyen, su detección solo puede ser indirecta, mediante secuenciación con una técnica de secuenciación de nueva generación y comparación con una referencia. MNase-seq utiliza una nucleasa microcócica que produce una escisión de una sola hebra en la hebra opuesta de la secuencia diana. [ 33 ] DNase-seq emplea DNasa I , una endonucleasa de doble hebra no específica. Esta técnica se ha utilizado hasta tal punto que las regiones libres de nucleosomas se han etiquetado como DHS, sitios hipersensibles a la DNasa I, [ 34 ] y ha sido el método de elección del consorcio ENCODE para análisis de accesibilidad de la cromatina en todo el genoma. [ 35 ] El principal problema de esta técnica es que la distribución de clivaje puede estar sesgada, [ 36 ] lo que reduce la calidad de los resultados.

FAIRE-seq (Aislamiento de Elementos Reguladores Asistido por Formaldehído) requiere como primer paso el entrecruzamiento del ADN con nucleosomas, seguido de la fragmentación del ADN mediante sonicación . Los fragmentos libres y unidos se separan con una extracción tradicional de fenol-cloroformo, ya que la fracción proteica queda atrapada en la interfase, mientras que el ADN no unido se desplaza a la fase acuosa y puede analizarse con diversos métodos. [ 37 ] La sonicación produce rupturas aleatorias y, por lo tanto, no está sujeta a ningún tipo de sesgo; además, la mayor longitud de los fragmentos (200-700 nt) hace que esta técnica sea adecuada para regiones más amplias, aunque no puede resolver el nucleosoma individual. [ 32 ] A diferencia de los métodos basados ​​en nucleasas, FAIRE-seq permite la identificación directa de los sitios transcripcionalmente activos y una preparación de muestras menos laboriosa. [ 38 ]

ATAC-seq se basa en la actividad de la transposasa Tn5. Esta transposasa se utiliza para insertar marcadores en el genoma, con mayor frecuencia en regiones no cubiertas por factores proteicos. Posteriormente, estos marcadores se utilizan como adaptadores para PRC u otras herramientas analíticas. [ 39 ]

Los métodos epigenómicos espaciales extienden los ensayos de accesibilidad de la cromatina y modificación de histonas a secciones de tejido intactas mediante la combinación de transposición in situ o perfiles basados ​​en anticuerpos con estrategias de codificación espacial. Un enfoque de este tipo, la codificación determinista en tejido (DBiT-seq), utiliza canales microfluídicos ortogonales para administrar códigos de barras posicionales y permite el mapeo de alta resolución espacial del estado de la cromatina y la expresión génica en tejidos fijados. [ 40 ] Las implementaciones comerciales de DBiT-seq, como la plataforma AtlasXomics, proporcionan chips microfluídicos y kits de reactivos para ATAC-seq espacial y CUT&Tag en tejidos frescos congelados y tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina, y se han utilizado para mapear la accesibilidad de la cromatina y las marcas de histonas en el ganglio de la raíz dorsal humana y otros tejidos de mamíferos. [ 41 ] [ 42 ]

Detección directa

La sensibilidad de la polimerasa en la secuenciación en tiempo real de molécula única permitió a los científicos detectar directamente marcas epigenéticas como la metilación a medida que la polimerasa se desplaza a lo largo de la molécula de ADN que se está secuenciando. [ 43 ] Varios proyectos han demostrado la capacidad de recopilar datos epigenéticos de todo el genoma en bacterias. [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ] [ 47 ]

La secuenciación de nanoporos se basa en cambios en las señales de corriente electrolítica según modificaciones de bases (p. ej., metilación). Una polimerasa media la entrada de ssDNA en el poro: la variación de la corriente iónica es modulada por una sección del poro y la diferencia generada se registra revelando la posición de CpG . La discriminación entre hidroximetilación y metilación es posible gracias a los nanoporos de estado sólido, aunque la corriente al pasar por la región de alto campo del poro puede verse ligeramente influenciada en ella. [ 48 ] Como referencia se utiliza ADN amplificado que no presentará sitios metilados copiados después del proceso de PCR . [ 49 ] El secuenciador MinION de Oxford Nanopore Technologies es una tecnología donde, según un modelo oculto de Markov , es posible distinguir la citosina no metilada de la metilada incluso sin tratamiento químico que actúe para mejorar la señal de esa modificación. Los datos se registran comúnmente en picoamperios durante un tiempo establecido. Otros dispositivos son el Nanopolish y el SignaAlign: el primero expresa la frecuencia de una metilación en una lectura, mientras que el segundo proporciona una probabilidad derivada de la suma de todas las lecturas. [ 50 ]

La secuenciación en tiempo real de molécula única (SMRT) es un método de secuenciación de ADN de molécula única. Este método utiliza una guía de ondas de modo cero (ZMW). Una enzima ADN polimerasa se une a la parte inferior de la ZMW con una molécula de ADN como plantilla. Cada una de las cuatro bases del ADN está unida a uno de cuatro colorantes fluorescentes diferentes . Cuando la ADN polimerasa incorpora un nucleótido, la etiqueta fluorescente se escinde y el detector detecta la señal fluorescente de la incorporación del nucleótido. A medida que se produce la secuenciación, la cinética de la enzima polimerasa cambia al encontrar una región de metilación o cualquier otra modificación de base. Cuando la enzima encuentra bases modificadas químicamente, su velocidad disminuye o aumenta de una manera única e identificable. Los pulsos de fluorescencia en la secuenciación SMRT se caracterizan no solo por sus espectros de emisión, sino también por su duración y por el intervalo entre pulsos sucesivos. Estas métricas, definidas como ancho de pulso y duración entre pulsos (DIP), aportan información valiosa sobre la cinética de la ADN polimerasa. El ancho de pulso depende de todas las etapas cinéticas posteriores a la unión del nucleótido y hasta la liberación del fluoróforo, mientras que la DIP está determinada por la cinética de la unión del nucleótido y la translocación de la polimerasa.

En 2010, un equipo de científicos demostró el uso de la secuenciación en tiempo real de molécula única para la detección directa de nucleótidos modificados en la plantilla de ADN, incluyendo N6-metiladenosina , 5-metilcitosina y 5-hidroxicitosina . Estas diversas modificaciones afectan la cinética de la polimerasa de manera diferente, lo que permite discriminarlas. [ 51 ]

En 2017, otro equipo propuso una conversión de bisulfito combinada con secuenciación en tiempo real de molécula única de tercera generación, denominada secuenciación de bisulfito en tiempo real de molécula única (SMRT-BS), que es un método preciso de análisis de metilación de CpG dirigido, capaz de un alto grado de multiplicación y longitudes de lectura largas (1,5 kb) sin necesidad de subclonación de amplicones de PCR. [ 52 ]

Enfoques de modelado teórico

Los primeros modelos matemáticos para diferentes estados de nucleosomas que afectan la expresión génica se introdujeron en la década de 1980 [ref]. Posteriormente, esta idea quedó casi olvidada, hasta que la evidencia experimental indicó un posible papel de las modificaciones covalentes de histonas como código epigenético . [ 53 ] En los años siguientes, los datos de alto rendimiento revelaron la abundancia de modificaciones epigenéticas y su relación con el funcionamiento de la cromatina, lo que motivó nuevos modelos teóricos para la aparición, el mantenimiento y el cambio de estos patrones. [ 54 ] [ 55 ] Estos modelos suelen formularse en el marco de enfoques de red unidimensionales. [ 56 ]

Véase también

Notas

  1. 1 2 3 Russell 2010 , pág. 217.
  2. 1 2 Russell 2010 , pág. 230.
  3. 1 2 Russell 2010 , pág. 475.
  4. ↑ Alabert C, Groth A (febrero de 2012). "Replicación de la cromatina y mantenimiento del epigenoma" ( PDF) . Nature Reviews. Biología Celular Molecular . 13 (3): 153– 67. doi : 10.1038/nrm3288 . PMID 22358331. S2CID 10911203 .  
  5. ↑ Ghosh S, Sinha JK, Raghunath M (septiembre de 2016). "El mantenimiento epigenómico mediante intervención dietética puede facilitar el proceso de reparación del ADN para ralentizar el avance del envejecimiento prematuro" . IUBMB Life . 68 (9): 717–21 . doi : 10.1002/iub.1532 . PMID 27364681 . 
  6. ↑ "El potencial epigenético y anticancerígeno de los flavonoides dietéticos" . 11 de octubre de 2016.
  7. 1 2 Zhu J, Adli M, Zou JY, Verstappen G, Coyne M, Zhang X, et al. (enero de 2013). "Transiciones del estado de la cromatina en todo el genoma asociadas con señales ambientales y de desarrollo" . Cell . 152 (3): 642– 54. doi : 10.1016/j.cell.2012.12.033 . PMC 3563935. PMID 23333102 .   
  8. ↑ Russell 2010 , pág. 597.
  9. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Laird PW (marzo de 2010). "Principios y desafíos del análisis de metilación del ADN en todo el genoma". Nature Reviews. Genetics . 11 (3): 191– 203. doi : 10.1038/nrg2732 . PMID 20125086. S2CID 6780101 .  
  10. ↑ Russell 2010 , págs. 531–2.
  11. 1 2 Bird A (enero de 2002). "Patrones de metilación del ADN y memoria epigenética" . Genes & Development . 16 (1): 6– 21. doi : 10.1101/gad.947102 . PMID 11782440 . 
  12. ↑ Russell 2010 , págs. 532–3.
  13. 1 2 3 4 5 Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schones DE, Wang Z, et al. (mayo de 2007). " Perfilado de alta resolución de metilaciones de histonas en el genoma humano" . Cell . 129 (4): 823–37 . doi : 10.1016/j.cell.2007.05.009 . PMID 17512414. S2CID 6326093 .   
  14. 1 2 3 4 5 6 7 Kouzarides T (febrero de 2007). "Modificaciones de la cromatina y su función" . Cell . 128 ( 4): 693–705 . doi : 10.1016/j.cell.2007.02.005 . PMID 17320507. S2CID 11691263 .  
  15. ↑ Russell 2010 , págs. 24–7.
  16. 1 2 Russell 2010 , págs. 529–30.
  17. ↑ Russell 2010 , pág. 530.
  18. ↑ Russell 2010 , pág. 218.
  19. ↑ Gross DS, Garrard WT (1988). "Sitios hipersensibles a nucleasas en la cromatina". Annual Review of Biochemistry . 57 : 159–97 . doi : 10.1146/annurev.bi.57.070188.001111 . PMID 3052270 . 
  20. ↑ Russell 2010 , pág. 529.
  21. 1 2 Gibson & Muse 2009 , págs. 229–32.
  22. ↑ Russell 2010 , pág. 532.
  23. 1 2 3 Eads CA, Danenberg KD, Kawakami K, Saltz LB, Blake C, Shibata D, et al. (abril de 2000). "MethyLight: un ensayo de alto rendimiento para medir la metilación del ADN" . Nucleic Acids Research . 28 (8): 32e–0. doi : 10.1093 / nar/28.8.e32 . PMC 102836. PMID 10734209 .   
  24. ↑ Russell 2010 , págs. 552–3.
  25. ↑ van der Ploeg LH, Flavell RA (abril de 1980). "Metilación del ADN en el locus de la globina beta gamma delta humana en tejidos eritroides y no eritroides". Cell . 19 ( 4): 947– 58. doi : 10.1016/0092-8674(80)90086-0 . PMID 6247075. S2CID 54324289 .  
  26. ↑ Johannes F, Colot V, Jansen RC (noviembre de 2008). "Dinámica del epigenoma: una perspectiva de genética cuantitativa" ( PDF) . Nature Reviews. Genetics . 9 (11): 883– 90. doi : 10.1038/nrg2467 . hdl : 11370/731f6c62-6749-4e67-aa72-c2242f95527a . PMID 18927581. S2CID 7641577 .  
  27. ↑ Trucchi E, Mazzarella AB, Gilfillan GD, Lorenzo MT, Schönswetter P, Paun O (abril de 2016). "BsRADseq: detección de metilación del ADN en poblaciones naturales de especies no modelo" . Molecular Ecology . 25 (8): 1697– 1713. Bibcode : 2016MolEc..25.1697T . doi : 10.1111/mec.13550 . PMC 4949719. PMID 26818626 .  
  28. ^ van Gurp TP, Wagemaker NC, Wouters B, Vergeer P, Ouborg JN, Verhoeven KJ (abril de 2016). "epiGBS: secuenciación de bisulfito de representación reducida sin referencias". Métodos de la naturaleza . 13 (4): 322– 324. doi : 10.1038/nmeth.3763 . PMID 26855363 . S2CID 10457615 .  
  29. ↑ Paun O, Verhoeven KJ, Richards CL (enero de 2019). "Oportunidades y limitaciones de la secuenciación de bisulfito de representación reducida en la epigenómica ecológica de plantas" . The New Phytologist . 221 (2): 738– 742. Bibcode : 2019NewPh.221..738P . doi : 10.1111/nph.15388 . PMC 6504643. PMID 30121954 .  
  30. ↑ Kundaje A, Meuleman W, Ernst J, Bilenky M, Yen A, Heravi-Moussavi A, et al. (febrero de 2015). " Análisis integrador de 111 epigenomas humanos de referencia" . Nature . 518 (7539): 317–30 . Bibcode : 2015Natur.518..317. . doi : 10.1038/nature14248 . PMC 4530010. PMID 25693563 .   
  31. ↑ Pennacchio LA, Bickmore W, Dean A, Nobrega MA, Bejerano G (abril de 2013). "Potenciadores: cinco preguntas esenciales" . Nature Reviews. Genetics . 14 (4): 288– 95. doi : 10.1038/nrg3458 . PMC 4445073. PMID 23503198 .  
  32. 1 2 Zhang Z, Pugh BF (enero de 2011). " Mapeo de alta resolución de la estructura primaria de la cromatina en todo el genoma" . Cell . 144 (2): 175– 86. doi : 10.1016/j.cell.2011.01.003 . PMC 3061432. PMID 21241889 .  
  33. ↑ Axel R (julio de 1975). "Escisión del ADN en núcleos y cromatina con nucleasa estafilocócica". Biochemistry . 14 (13): 2921– 5. doi : 10.1021/bi00684a020 . PMID 1148185 . 
  34. ↑ Zhou W, Sherwood B, Ji Z, Xue Y, Du F, Bai J, et al. (octubre de 2017). "Predicción a nivel genómico de la hipersensibilidad a la DNasa I mediante la expresión génica" . Nature Communications . 8 (1) 1038. Bibcode : 2017NatCo...8.1038Z . doi : 10.1038/s41467-017-01188- x . PMC 5715040. PMID 29051481 .   
  35. ↑ Aldred SF, Collins PJ, Davis CA, Doyle F, Epstein CB, Frietze S, et al. (Consorcio del Proyecto ENCODE) (septiembre de 2012). " Una enciclopedia integrada de elementos de ADN en el genoma humano" . Nature . 489 (7414): 57–74 . Bibcode : 2012Natur.489...57T . doi : 10.1038/nature11247 . PMC 3439153. PMID 22955616 .   
  36. ↑ He HH, Meyer CA, Hu SS, Chen MW, Zang C, Liu Y, et al. (enero de 2014). " Protocolo de DNase-seq refinado y análisis de datos revelan un sesgo intrínseco en la identificación de huellas de factores de transcripción" . Nature Methods . 11 (1): 73–78 . doi : 10.1038/nmeth.2762 . PMC 18771. PMID 24317252 .   
  37. ↑ Tsompana M, Buck MJ (20 de noviembre de 2014). "Accesibilidad de la cromatina: una ventana al genoma" . Epigenetics & Chromatin . 7 (1) 33. doi : 10.1186/1756-8935-7-33 . PMC 4253006. PMID 25473421 .  
  38. ↑ Giresi PG, Kim J, McDaniell RM, Iyer VR, Lieb JD (junio de 2007). "FAIRE (Aislamiento asistido por formaldehído de elementos reguladores) aísla elementos reguladores activos de la cromatina humana" . Genome Research . 17 (6): 877–85 . doi : 10.1101/gr.5533506 . PMC 1891346. PMID 17179217 .  
  39. ↑ Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ (diciembre de 2013). "Transposición de cromatina nativa para un perfilado epigenómico rápido y sensible de cromatina abierta, proteínas de unión al ADN y posición de nucleosomas" . Nature Methods . 10 (12): 1213–8 . doi : 10.1038/nmeth.2688 . PMC 3959825. PMID 24097267 .  
  40. ↑ Liu Y, Yang M, Deng Y, Su G, Enninful A, Guo CC, et al. (2020-12-10). "Secuenciación multiómica de alta resolución espacial mediante codificación de barras determinista en tejido" . Cell . 183 ( 6): 1665–1681.e18. doi : 10.1016/j.cell.2020.10.026 . ISSN 0092-8674 . PMC 7736559. PMID 33188776 .    
  41. ↑ "Plataforma DBiT-seq para epigenómica espacial de alta resolución" . AtlasXomics . Consultado el 13 de noviembre de 2025 .
  42. ↑ Hamilton ES (2025). "Paisaje epigenómico del ganglio de la raíz dorsal humana revelado por ATAC-seq espacial y CUT&Tag". PAIN . 166 (3): 345– 358. doi : 10.1097/j.pain.0000000000003048 .
  43. ↑ Schadt EE, Banerjee O, Fang G, Feng Z, Wong WH, Zhang X, et al. (enero de 2013). " Modelado de la variación de la tasa cinética en datos de secuenciación de ADN de tercera generación para detectar posibles modificaciones en las bases del ADN" . Genome Research . 23 (1): 129– 41. doi : 10.1101/gr.136739.111 . PMC 3530673. PMID 23093720 .   
  44. ↑ Davis BM, Chao MC, Waldor MK (abril de 2013). "Entrando en la era de la epigenómica bacteriana con la secuenciación de ADN en tiempo real de molécula única" . Current Opinion in Microbiology . 16 (2): 192–8 . doi : 10.1016/j.mib.2013.01.011 . PMC 3646917. PMID 23434113 .  
  45. ↑ Lluch-Senar M, Luong K, Lloréns-Rico V, Delgado J, Fang G, Spittle K, et al. (2013). " Caracterización integral del metiloma de Mycoplasma genitalium y Mycoplasma pneumoniae con resolución de una sola base" . PLOS Genetics . 9 (1) e1003191. doi : 10.1371/journal.pgen.1003191 . PMC 3536716. PMID 23300489 .   
  46. ↑ Murray IA, Clark TA, Morgan RD, Boitano M, Anton BP, Luong K, et al. (diciembre de 2012). " Los metilomas de seis bacterias" . Nucleic Acids Research . 40 (22): 11450– 62. doi : 10.1093/nar/gks891 . PMC 3526280. PMID 23034806 .   
  47. ↑ Fang G, Munera D, Friedman DI, Mandlik A, Chao MC, Banerjee O, et al. (diciembre de 2012). "Mapeo a nivel genómico de residuos de adenina metilados en Escherichia coli patógena mediante secuenciación en tiempo real de molécula única" . Nature Biotechnology . 30 (12): 1232–9 . doi : 10.1038/nbt.2432 . PMC 3879109. PMID 23138224 .   
  48. ↑ Simpson JT, Workman RE, Zuzarte PC, David M, Dursi LJ, Timp W (abril de 2017). "Detección de metilación de citosina del ADN mediante secuenciación de nanoporos" ( PDF) . Nature Methods . 14 (4): 407– 410. doi : 10.1038/nmeth.4184 . PMID 28218898. S2CID 16152628 .  
  49. ↑ Laszlo AH, Derrington IM, Brinkerhoff H, Langford KW, Nova IC, Samson JM, et al. (noviembre de 2013). "Detección y mapeo de 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina con MspA de nanoporos" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 110 (47): 18904– 9. Bibcode : 2013PNAS..11018904L . doi : 10.1073/pnas.1310240110 . PMC 3839702. PMID 24167255 .   
  50. ↑ Jain M, Koren S, Miga KH, Quick J, Rand AC, Sasani TA, et al. (abril de 2018). "Secuenciación y ensamblaje de un genoma humano con lecturas ultralargas mediante nanoporos" . Nature Biotechnology . 36 (4): 338– 345. doi : 10.1038/nbt.4060 . PMC 5889714. PMID 29431738 .   
  51. ↑ Flusberg BA, Webster DR, Lee JH, Travers KJ, Olivares EC, Clark TA, et al. (junio de 2010). "Detección directa de la metilación del ADN durante la secuenciación en tiempo real de molécula única" . Nature Methods . 7 (6): 461– 5. doi : 10.1038/nmeth.1459 . PMC 2879396. PMID 20453866 .   
  52. ↑ Yang Y, Scott SA (2017). "Perfil de metilación del ADN mediante secuenciación de bisulfito en tiempo real de molécula única de lectura larga (SMRT-BS)". Genómica funcional . Métodos en biología molecular. Vol. 1654. págs. 125–134 . doi : 10.1007/978-1-4939-7231-9_8 . ISBN   978-1-4939-7230-2. PMID 28986786 . 
  53. ↑ Strahl BD, Allis CD (enero de 2000). "El lenguaje de las modificaciones covalentes de las histonas". Nature . 403 ( 6765): 41– 5. Bibcode : 2000Natur.403...41S . doi : 10.1038/47412 . PMID 10638745. S2CID 4418993 .  
  54. ↑ Sedighi M, Sengupta AM (noviembre de 2007). "Silenciamiento epigenético de la cromatina: biestabilidad y propagación del frente" . Biología Física . 4 (4): 246– 55. arXiv : 0710.3889 . Bibcode : 2007PhBio...4..246S . doi : 10.1088/ 1478-3975 /4/4/002 . PMC 2267688. PMID 17991991 .  
  55. ↑ Dodd IB, Micheelsen MA, Sneppen K, Thon G (mayo de 2007). "Análisis teórico de la memoria celular epigenética mediante la modificación de nucleosomas" . Cell . 129 (4): 813–22 . doi : 10.1016/j.cell.2007.02.053 . PMID 17512413. S2CID 16091877 .  
  56. ↑ Teif VB, Rippe K (octubre de 2010). "Modelos de red mecánico-estadísticos para la unión proteína-ADN en la cromatina". Journal of Physics: Condensed Matter . 22 (41) 414105. arXiv : 1004.5514 . Bibcode : 2010JPCM...22O4105T . doi : 10.1088/0953-8984/22/41/414105 . PMID 21386588 . S2CID 103345 .  

Referencias

  • Gibson G, Muse SV (2009). Introducción a la ciencia del genoma (3.ª  ed.). Sunderland: Sinaeur Associates. ISBN 978-0-87893-236-8.
  • Russell PJ (2010). iGenetics: Un enfoque molecular (3.ª  ed.). San Francisco: Pearson Benjamin Cummings. ISBN 978-0-321-56976-9.

Lecturas adicionales

  • Bodnar JW, Bradley MK (noviembre de 1996). "Un interruptor de cromatina" . Journal of Theoretical Biology . 183 (1): 1– 7. Bibcode : 1996JThBi.183....1B . doi : 10.1006/jtbi.1996.0195 . PMID 8959107 . 
  • Cartwright IL (octubre de 1987). " Cambio en la estructura de la cromatina durante el desarrollo asociado con el uso alternativo de promotores en el gen de la alcohol deshidrogenasa de Drosophila melanogaster" . The EMBO Journal . 6 (10): 3097–101 . doi : 10.1002/j.1460-2075.1987.tb02618.x . PMC 553749. PMID 3121305 .  
  • "2 Patrones de cromatina en sitios de unión de factores de transcripción" . Nature : 1. 2019. doi : 10.1038/nature28171 .