ATAC-seq

ATAC-seq ( Ensayo para la cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación ) es una técnica de laboratorio utilizada en biología molecular para evaluar la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma . ^{[ 1 ]} La técnica fue introducida en 2013 por los laboratorios de Will Greenleaf y Howard Chang en la Universidad de Stanford como una alternativa a MNase-seq , FAIRE-Seq y DNase-Seq ^{[ 1 ]} con un tiempo de respuesta más rápido, un protocolo más simple y menores requisitos de entrada de ADN. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]}

ATAC-seq identifica regiones de ADN accesibles mediante el sondeo de la cromatina abierta con la transposasa Tn5 mutante hiperactiva , que inserta adaptadores de secuenciación en regiones abiertas del genoma. ^{[ 2 ] [ 5 ]} Si bien las transposasas naturales tienen un bajo nivel de actividad, ATAC-seq emplea la transposasa hiperactiva mutada. ^{[ 6 ]} En un proceso llamado "tagmentación", la transposasa Tn5 corta y marca el ADN de doble cadena con adaptadores de secuenciación en un solo paso enzimático. ^{[ 7 ] [ 8 ]} Los fragmentos de ADN marcados se purifican, se amplifican por PCR y se secuencian mediante secuenciación de próxima generación . ^{[ 8 ]} Las lecturas de secuenciación se pueden usar para inferir regiones de mayor accesibilidad, así como para mapear regiones de sitios de unión de factores de transcripción y posiciones de nucleosomas. ^{[ 2 ]} El número de lecturas para una región se correlaciona con el grado de apertura de esa cromatina, con resolución de un solo nucleótido. ^{[ 2 ]}

ATAC-seq no requiere sonicación ni extracción con fenol-cloroformo como FAIRE-seq; ^{[ 9 ]} no requiere anticuerpos como ChIP-seq ; ^{[ 10 ]} y no requiere digestión enzimática sensible como MNase-seq o DNase-seq. ^{[ 11 ]} La preparación de ATAC-seq puede completarse en menos de tres horas. ^{[ 12 ]}

El análisis ATAC-Seq se utiliza para investigar diversas firmas de accesibilidad de la cromatina. Su uso más común son los experimentos de mapeo de nucleosomas , ^{[ 3 ]} pero también puede aplicarse al mapeo de sitios de unión de factores de transcripción , ^{[ 13 ]} adaptado para mapear sitios de metilación del ADN , ^{[ 14 ]} o combinado con técnicas de secuenciación. ^{[ 15 ]}

La utilidad del mapeo de potenciadores de alta resolución abarca desde el estudio de la divergencia evolutiva del uso de potenciadores (por ejemplo, entre chimpancés y humanos) durante el desarrollo ^{[ 16 ]} hasta el descubrimiento de un mapa de potenciadores específico de linaje utilizado durante la diferenciación de células sanguíneas . ^{[ 17 ]}

ATAC-Seq también se ha aplicado para definir el panorama de accesibilidad de la cromatina en todo el genoma en cánceres humanos, ^{[ 18 ]} y para revelar una disminución general en la accesibilidad de la cromatina en la degeneración macular . ^{[ 19 ]} Se pueden realizar métodos de huella computacional en ATAC-seq para encontrar sitios de unión específicos de células y factores de transcripción con actividad específica de células. ^{[ 13 ]}

ATAC-seq ha encontrado aplicaciones cada vez mayores en la investigación clínica y los estudios de enfermedades. EPIC-ATAC se ha desarrollado como un marco de deconvolución para cuantificar la heterogeneidad del tipo celular en datos ATAC-seq de tumores masivos, lo que permite el análisis de los procesos reguladores subyacentes al desarrollo tumoral y la correlación con variables clínicas en la investigación del cáncer. ^{[ 20 ] [ 21 ]} En inmunología , ATAC-seq se ha utilizado para caracterizar cambios epigenéticos dinámicos en el agotamiento de las células T , revelando que las células T agotadas poseen patrones de accesibilidad de la cromatina únicos en comparación con las células T vírgenes, efectoras y de memoria, con implicaciones para la inmunoterapia del cáncer . ^{[ 22 ]} El Atlas del Genoma del Cáncer ha generado perfiles de accesibilidad de la cromatina en todo el genoma de 410 muestras tumorales que abarcan 23 tipos de cáncer, identificando 562 709 elementos de ADN accesibles a la transposasa y revelando loci de riesgo genético de predisposición al cáncer como elementos reguladores de ADN activos. ^{[ 23 ]} El análisis integrador que combina ATAC-seq con RNA-seq se ha utilizado para identificar nuevos oncogenes y dilucidar mecanismos reguladores en el carcinoma hepatocelular . ^{[ 24 ]}

Se han realizado modificaciones al protocolo ATAC-seq para adaptarlo al análisis de células individuales . La microfluídica puede utilizarse para separar núcleos individuales y realizar reacciones ATAC-seq de forma individual. ^{[ 12 ]} Con este enfoque, las células individuales se capturan mediante un dispositivo microfluídico o un sistema de deposición líquida antes de la fragmentación. ^{[ 12 ] [ 25 ]} Una técnica alternativa que no requiere el aislamiento de células individuales es la indexación celular combinatoria. ^{[ 26 ]} Esta técnica utiliza códigos de barras para medir la accesibilidad de la cromatina en miles de células individuales; puede generar perfiles epigenómicos de 10 000 a 100 000 células por experimento. ^{[ 27 ]} Pero la indexación celular combinatoria requiere equipo adicional diseñado a medida o una gran cantidad de Tn5 modificado a medida. ^{[ 28 ]} Recientemente, se desarrolló un método de código de barras agrupado llamado sci-CAR, que permite el perfilado conjunto de la accesibilidad de la cromatina y la expresión génica de células individuales. ^{[ 29 ]}

El análisis computacional de scATAC-seq se basa en la construcción de una matriz de recuento con el número de lecturas por región de cromatina abierta. Las regiones de cromatina abierta se pueden definir, por ejemplo, mediante la detección estándar de picos en datos pseudo-bulk ATAC-seq. Los pasos posteriores incluyen la reducción de datos con PCA y la agrupación de células. ^{[ 25 ]} Las matrices de scATAC-seq pueden ser extremadamente grandes (cientos de miles de regiones) y extremadamente dispersas, es decir, menos del 3% de las entradas son distintas de cero. ^{[ 30 ]} Por lo tanto, la imputación de la matriz de recuento es otro paso crucial que se realiza utilizando varios métodos, como la factorización de matrices no negativas . Al igual que con bulk ATAC-seq, scATAC-seq permite encontrar reguladores como factores de transcripción que controlan la expresión génica de las células. Esto se puede lograr observando el número de lecturas alrededor de los motivos de TF ^{[ 31 ]} o mediante análisis de huella . ^{[ 30 ]}

La técnica ATAC-seq espacial combina el perfilado de accesibilidad de la cromatina con información espacial, lo que permite a los investigadores mapear paisajes epigenéticos preservando la arquitectura tisular. Este método combina la química de transposición Tn5 in situ con el código de barras determinista microfluídico para realizar análisis de accesibilidad de la cromatina con resolución espacial en secciones de tejido a nivel celular y genómico. ^{[ 32 ] [ 33 ]} La técnica se ha aplicado al co-perfilado del epigenoma y el transcriptoma, facilitando la investigación de la correlación entre picos accesibles y genes expresados ​​píxel a píxel en el contexto tisular. ^{[ 32 ]}

Entre los avances recientes se incluye SPACE-seq (SPatial assay for Accessible chromatin, Cell lineages, and gene Expression with sequencing), que permite el análisis simultáneo de la expresión génica, la accesibilidad de la cromatina y las mutaciones del ADN mitocondrial utilizando plataformas de transcriptómica espacial disponibles comercialmente . ^{[ 34 ]} También se ha desarrollado la microdisección por captura láser acoplada a ATAC-seq (LCM-ATAC-seq) para el análisis dirigido de la accesibilidad de la cromatina de poblaciones celulares discretas, contiguas o dispersas en tejidos, lo que permite el análisis a resolución de mini-bulk con la posibilidad de integrar tinciones celulares o morfológicas. ^{[ 35 ]}

AtlasXomics ofrece una forma comercialmente implementada de codificación de barras determinista para ATAC-seq espacial, comercializando la tecnología de codificación de barras microfluídica DBiT-seq desarrollada originalmente en el laboratorio de Fan. ^{[ 36 ]} La plataforma genera  píxeles espaciales de ~10 μm a través de flujos de codificación de barras microfluídica ortogonales y es compatible con secciones de tejido tanto frescas congeladas como FFPE (fijadas en formalina e incluidas en parafina). Las aplicaciones revisadas por pares de ATAC-seq espacial basado en AtlasXomics incluyen el mapeo del paisaje de accesibilidad de la cromatina del ganglio de la raíz dorsal humana utilizando ATAC-seq espacial combinado con CUT&Tag. ^{[ 37 ]} Se han publicado estudios adicionales que utilizan esta plataforma en forma de preimpresión, extendiendo el análisis epigenómico espacial a modelos de cáncer, tejidos en desarrollo y microambientes inmunitarios. ^{[ 38 ] [ 39 ]}

Los avances recientes han permitido el perfilado simultáneo de la accesibilidad de la cromatina junto con otras modalidades moleculares en las mismas células o secciones de tejido. El ATAC-RNA-seq espacial y el CUT&Tag-RNA-seq espacial permiten el co-perfilado de la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma o las modificaciones de histonas junto con el transcriptoma completo en la misma sección de tejido con una resolución cercana a la de una sola célula. ^{[ 32 ]} ISSAAC-seq (Secuenciación in situ de la accesibilidad de la cromatina y los transcriptomas celulares) representa una actualización multimodal del ATAC-seq, proporcionando un método potente para investigar la expresión génica y la accesibilidad de la cromatina dentro de la misma célula con alta sensibilidad y menor coste que los kits disponibles comercialmente. ^{[ 40 ]} Estos enfoques multimodales han llevado al desarrollo de herramientas computacionales como SCRIPro, que combina la importancia del factor de transcripción-diana de datos epigenómicos con la expresión del factor de transcripción -diana de datos transcriptómicos para construir redes reguladoras de genes a partir de datos multiómicos espaciales y de células individuales. ^{[ 41 ]}

El análisis de datos ATAC-seq presenta desafíos metodológicos únicos debido a la escasez de datos y la necesidad de herramientas bioinformáticas especializadas . Los pasos principales incluyen el preanálisis (control de calidad y alineación), el análisis central (llamada de picos) y el análisis avanzado (análisis diferencial de picos y anotación, enriquecimiento de motivos, huella y análisis de posición de nucleosomas). ^{[ 42 ] [ 43 ]} MACS2 (Model-based Analysis of ChIP-seq 2) sigue siendo el llamador de picos más utilizado para el análisis de datos ATAC-seq, sirviendo como llamador de picos predeterminado en el pipeline ENCODE ATAC-seq. Desarrollado originalmente para ChIP-seq, MACS2 se ha adaptado para el análisis ATAC-seq y funciona bien para identificar regiones de accesibilidad de transposasa enriquecida, aunque requiere optimización de parámetros para características específicas de ATAC-seq. ^{[ 44 ] [ 45 ]} Se han desarrollado flujos de trabajo de análisis estandarizados, incluido el pipeline nf-core/atacseq, que proporciona un marco integral y reproducible para el procesamiento de datos ATAC-seq desde lecturas crudas hasta llamadas de picos finales y métricas de control de calidad. Este pipeline basado en Nextflow incorpora las mejores prácticas para el recorte de adaptadores, alineación, eliminación de duplicados, llamada de picos y análisis posterior, lo que facilita el procesamiento estandarizado en diferentes grupos de investigación y entornos computacionales. ^{[ 46 ] [ 47 ]}

• ScGET-seq
• Análisis de células individuales
• William Greenleaf (científico estadounidense)
• Howard Y. Chang

• Las sondas ATAC-seq analizan el estado de cromatina abierta (figura).
• ATAC-seq: Perfilado epigenómico rápido y sensible
• HINT-ATAC: Identificación de sitios de unión de factores de transcripción mediante ATAC-seq