transcriptómica espacial

La microdisección por captura láser permite capturar células individuales sin causar alteraciones morfológicas. ^{[ 20 ] [ 21 ]} Emplea una película transparente de etileno vinil acetato en contacto con la sección histológica y un haz láser infrarrojo de baja potencia. ^{[ 20 ]} Una vez que dicho haz se dirige a las células de interés, la película directamente sobre el área objetivo se funde temporalmente de modo que sus polímeros de cadena larga cubren y capturan firmemente las células. ^{[ 20 ]} Luego, se retira la sección y las células de interés permanecen incrustadas en la película. ^{[ 20 ]} Este método permite un posterior perfilado de transcripción de ARN y la generación de una biblioteca de ADNc de las células recuperadas.

La secuenciación de ARN de las regiones seleccionadas en criosecciones individuales es otro método que puede producir datos de expresión genómica basados ​​en la ubicación. ^{[ 22 ]} Este método se lleva a cabo sin microdisección por captura láser. Se utilizó por primera vez para determinar patrones espaciales de expresión génica en todo el genoma en embriones de Drosophila crioseccionados. ^{[ 22 ]} Esencialmente, implica una preparación simple de la biblioteca a partir de las regiones seleccionadas de la muestra. Este método tuvo dificultades para obtener bibliotecas de RNA-seq de alta calidad de cada sección debido a la pérdida de material como resultado de la pequeña cantidad de ARN total en cada sección. ^{[ 4 ] [ 22 ]} Este problema se resolvió agregando ARN de una especie de Drosophila distantemente relacionada a cada tubo después de la extracción inicial de ARN. ^{[ 22 ]}

El GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) ( NanoString Technologies ) es el primer instrumento comercial automatizado desarrollado para el perfilado espacial de ARN y proteínas en secciones de tejido de archivo fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE). ^{[ 23 ]} FFPE es un tipo de muestra común en el campo de la patología e histología debido a su preservación a largo plazo de la estructura del tejido. La tecnología GeoMx DSP se centra en la capacidad del usuario para realizar una "microdisección" basada en estructuras histológicas, compartimentos funcionales y tipos de células. Sin embargo, a diferencia de LCM , el perfilado de expresión génica se realiza de manera no destructiva mediante luz, debido a un código de barras fotocindible por UV incorporado en la sonda de hibridación in situ . Para ello, las secciones de tejido en portaobjetos de microscopio se tiñen con anticuerpos fluorescentes y colorante nuclear para visualizar toda la sección de tejido con resolución de célula individual en el instrumento DSP. ^{[ 23 ]} La selección de la región de interés se realiza mediante segmentación automatizada en intensidades de señal fluorescente o herramientas de dibujo, incluyendo formas geométricas o a mano alzada. ^{[ 23 ]} Cada región de interés se expone con precisión a luz UV y los códigos de barras se cortan, se recogen y se utilizan para identificar ARN o proteínas presentes en el tejido. ^{[ 24 ]} Las regiones de interés definidas pueden variar en tamaño, entre diez y seiscientos micrómetros, lo que permite una amplia variedad de estructuras y células en la muestra histológica. ^{[ 4 ] [ 25 ]} GeoMx DSP puede resolver espacialmente y medir transcriptomas completos humanos o de ratón, ^{[ 26 ]} más de 1200 proteínas, o tanto ARN como proteínas en protocolos multiómicos de la misma lámina. ^{[ 27 ]}

El análisis del transcriptoma in vivo (TIVA) es una técnica que permite capturar ARNm en células individuales vivas en secciones de tejido vivo intacto. [ ^{28 ] Utiliza} una etiqueta fotoactivable. ^{[ 4 ] [ 28 ]} La etiqueta TIVA tiene varios grupos funcionales y un oligonucleótido de poli(U) atrapado acoplado a biotina. ^{[ 28 ]} Un péptido unido por enlaces disulfuro, que es adyacente a la etiqueta, le permite penetrar la membrana celular. ^{[ 28 ]} Una vez dentro, se utiliza fotoactivación láser para desbloquear el oligonucleótido de poli(U) en las células de interés, de modo que la etiqueta TIVA se hibride con los ARNm dentro de la célula. ^{[ 28 ]} Luego, se utiliza la captura de estreptavidina del grupo biotina para extraer moléculas de ARNm con cola de poli(A) unidas a etiquetas desbloqueadas, después de lo cual estos ARNm se analizan mediante secuenciación de ARN. ^{[ 28 ]} Este método está limitado por un bajo rendimiento, ya que solo se pueden procesar unas pocas células individuales a la vez. ^{[ 4 ]}

Una alternativa avanzada a la secuenciación de ARN de criosecciones individuales descrita anteriormente, la tomografía de ARN (tomo-seq) ofrece una mejor cuantificación de ARN y resolución espacial. ^{[ 29 ]} También se basa en la criosección de tejido con posterior secuenciación de ARN de secciones individuales, lo que produce datos de expresión de todo el genoma y preserva la información espacial. ^{[ 29 ]} En este protocolo, se omite el uso de ARN portador debido a la amplificación lineal del ADNc en secciones histológicas individuales. ^{[ 29 ]} La misma muestra se secciona en diferentes direcciones seguida de una construcción transcripcional 3D utilizando datos superpuestos. ^{[ 29 ]} En general, este método implica el uso de muestras idénticas para cada sección y, por lo tanto, no se puede aplicar para el procesamiento de material clínico. ^{[ 4 ]}

LCM-seq utiliza microdisección por captura láser (LCM) acoplada con secuenciación de ARN Smart-Seq2 y es aplicable hasta el nivel de célula individual, pudiendo incluso utilizarse en tejidos parcialmente degradados. El flujo de trabajo incluye criosección de tejidos seguida de microdisección por captura láser, donde las células se recogen directamente en tampón de lisis y se genera ADNc sin necesidad de aislamiento de ARN, lo que simplifica los procedimientos experimentales y reduce el ruido técnico. ^{[ 30 ] [ 31 ]} Dado que la identidad posicional de cada célula se registra durante el procedimiento LCM, el transcriptoma de cada célula tras la secuenciación de ARN de la biblioteca de ADNc correspondiente puede inferirse a partir de la posición de donde fue aislada. ^{[ 30 ]} LCM-seq se ha aplicado a múltiples tipos de células para comprender sus propiedades intrínsecas, incluyendo neuronas oculomotoras, neuronas motoras faciales, neuronas motoras hipoglosas, neuronas motoras espinales, neuronas del núcleo rojo, ^{[ 32 ]} interneuronas, ^{[ 33 ]} neuronas dopaminérgicas, ^{[ 34 ]} y condrocitos. ^{[ 35 ]}

Geo-seq es un método que utiliza tanto la microdisección por captura láser como los procedimientos de secuenciación de ARN de célula única para determinar la distribución espacial del transcriptoma en áreas de tejido de aproximadamente diez células de tamaño. ^{[ 7 ]} El flujo de trabajo implica la extracción y criosección del tejido seguida de la microdisección por captura láser. ^{[ 7 ] [ 36 ]} El tejido extraído se lisa, y el ARN se purifica y se transcribe inversamente en una biblioteca de ADNc. ^{[ 7 ] [ 36 ]} La biblioteca se secuencia y el perfil transcriptómico se puede mapear a la ubicación original del tejido extraído. ^{[ 7 ] [ 36 ]} Esta técnica permite al usuario definir regiones de interés en un tejido, extraer dicho tejido y mapear el transcriptoma en un enfoque dirigido.

El método NICHE-seq utiliza marcadores fluorescentes fotoactivables y microscopía de barrido láser de dos fotones para proporcionar datos espaciales al transcriptoma generado. ^{[ 37 ]} Las células unidas al marcador fluorescente se fotoactivan, disocian y clasifican mediante clasificación celular activada por fluorescencia. ^{[ 37 ]} Esto proporciona especificidad de clasificación solo a las células marcadas y fotoactivadas. ^{[ 37 ]} Tras la clasificación, la secuenciación de ARN de célula única genera el transcriptoma de las células visualizadas. ^{[ 37 ]} Este método puede procesar miles de células dentro de un nicho definido a costa de perder datos espaciales entre las células del nicho. ^{[ 37 ]}

ProximID es una metodología basada en la microdigestión iterativa de tejido extraído a células individuales. ^{[ 38 ]} Los pasos iniciales de digestión suave preservan pequeñas estructuras interactivas que se registran antes de continuar la digestión. ^{[ 38 ]} Luego, las células individuales se separan de cada estructura y se someten a sc-RNAseq y se agrupan utilizando incrustación estocástica de vecinos distribuidos en t. ^{[ 38 ] [ 39 ]} Las células agrupadas se pueden mapear a interacciones físicas basadas en las estructuras interactivas antes de las microdigesciones. ^{[ 38 ]} Si bien el rendimiento de esta técnica es relativamente bajo, proporciona información sobre la interacción física entre células al conjunto de datos. ^{[ 4 ]}

El sistema de imágenes moleculares espaciales CosMx ( NanoString Technologies ) es la primera plataforma de análisis in situ de alta complejidad que proporciona multiómica espacial con muestras de tejido fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE) y congeladas (FF) con resolución celular y subcelular. Permite la cuantificación y visualización rápidas de hasta el transcriptoma completo ^{[ 40 ]} y 64 analitos proteicos validados, y es la plataforma flexible de imágenes espaciales de células individuales para la creación de atlas celulares, la fenotipificación de tejidos, las interacciones célula-célula, los procesos celulares y el descubrimiento de biomarcadores. ^{[ 41 ]}

Una de las primeras técnicas capaces de lograr el perfilado de ARN con resolución espacial de células individuales fue la hibridación fluorescente in situ de molécula única ( smFISH ) . ^{[ 42 ]} Implementó sondas de oligonucleótidos cortas (50 pares de bases) conjugadas con 5 fluoróforos que podían unirse a un transcrito específico produciendo puntos brillantes en la muestra. ^{[ 42 ]} La detección de estos puntos proporciona información cuantitativa sobre la expresión de ciertos genes en la célula. ^{[ 42 ]} Sin embargo, el uso de sondas marcadas con múltiples fluoróforos presentó desafíos debido a la autoextinción, las características de hibridación alteradas, su síntesis y purificación. ^{[ 4 ]}

Posteriormente, este método se modificó ^{[ 43 ]} sustituyendo las sondas descritas anteriormente por otras de 20 pb de longitud, acopladas a un único fluoróforo y complementarias en tándem a una secuencia de ARNm de interés, lo que significa que se unirían colectivamente al ARNm diana. Una sola sonda de este tipo no produciría una señal fuerte, pero la fluorescencia acumulativa de las sondas agrupadas mostraría un punto brillante. Dado que es improbable que las sondas individuales mal unidas se localicen conjuntamente, las señales falsas positivas en este método son limitadas. ^{[ 4 ]}

De este modo, esta técnica de hibridación in situ (ISH) detecta la localización espacial de la expresión de ARN mediante la obtención de imágenes directas de moléculas de ARN individuales en células individuales.

Otra técnica de hibridación in situ denominada RNAscope emplea sondas con un diseño específico en forma de Z para amplificar simultáneamente las señales de hibridación y suprimir el ruido de fondo. ^{[ 44 ]} Permite la visualización de ARN individuales en una variedad de tipos celulares. ^{[ 45 ]} La mayoría de los pasos de RNAscope son similares al protocolo ISH clásico. ^{[ 44 ]} La muestra de tejido se fija en portaobjetos y luego se trata con reactivos RNAscope que penetran en las células. Las sondas Z están diseñadas de manera que solo son efectivas cuando se unen en pares a la secuencia objetivo. ^{[ 44 ]} Esto permite que otro elemento de este método (preamplificador) se conecte a las colas superiores de las sondas Z. ^{[ 44 ]} Una vez fijado, el preamplificador sirve como sitio de unión para otros elementos: amplificadores que a su vez se unen a otro tipo de sondas: sondas de marcaje. ^{[ 44 ]} Como resultado, se forma una estructura voluminosa en la secuencia objetivo. Lo más importante es que el preamplificador no se une a una sonda Z singular, por lo que la unión no específica no implicaría la emisión de señal, eliminando así el ruido de fondo mencionado al principio. ^{[ 4 ] [ 44 ]}

La hibridación in situ de fluorescencia secuencial ( seqFISH ) es otro método que proporciona la identificación de ARNm directamente en células individuales con preservación de su contexto espacial. [ ^{46 ] [ 47 ] Este} método se lleva a cabo en múltiples rondas; cada una de ellas incluye hibridación de sonda fluorescente, obtención de imágenes y eliminación consecutiva de la sonda. ^{[ 46 ]} A varios genes se les asignan diferentes colores en cada ronda, generando un código de barras temporal único. ^{[ 46 ]} Por lo tanto, seqFISH distingue los ARNm por un código de color secuencial, como rojo-rojo-verde. Sin embargo, esta técnica tiene sus defectos, como el fondo autofluorescente y los altos costos debido a la cantidad de sondas utilizadas en cada ronda. ^{[ 4 ]}

Los métodos FISH convencionales están limitados por el pequeño número de genes que se pueden analizar simultáneamente debido al pequeño número de canales de color distintos, por lo que se diseñó FISH robusto a errores multiplexado para superar este problema. [ ^{48 ] El} FISH robusto a errores multiplexado ( MERFISH ) aumenta considerablemente el número de especies de ARN que se pueden visualizar simultáneamente en células individuales empleando el etiquetado de genes con código binario en múltiples rondas de hibridación. ^{[ 49 ]} Este enfoque puede medir 140 especies de ARN a la vez utilizando un esquema de codificación que detecta y corrige errores. ^{[ 49 ]} El principio fundamental reside en la identificación de genes mediante la combinación de señales de varias rondas de hibridación consecutivas y la asignación de códigos de barras binarios de N bits a los genes de interés. ^{[ 49 ]} El código depende de sondas específicas y comprende valores "1" o "0" y su combinación se establece de manera diferente para cada gen. ^{[ 49 ]} Los errores se evitan utilizando códigos de seis bits o más, con dos cualesquiera de ellos difiriendo en al menos 3 bits. ^{[ 49 ]} Se crea una sonda específica para cada especie de ARN. ^{[ 49 ]} Cada sonda es un oligonucleótido específico del objetivo que consta de 20-30 pares de bases y se une complementariamente a la secuencia de ARNm después de permear la célula. ^{[ 49 ]} Luego, se realizan múltiples rondas de hibridación de la siguiente manera: para cada ronda, solo se agrega una sonda que incluye "1" en la posición del código binario correspondiente. ^{[ 49 ]} Al final de cada ronda, se utiliza microscopía de fluorescencia para localizar cada sonda. ^{[ 49 ]} Como era de esperar, solo se capturarían aquellos ARNm que tenían "1" en la posición asignada. ^{[ 49 ]} Luego, las fotos se fotoblanquean y se agrega un nuevo subconjunto. ^{[ 49 ]} De esta manera, recuperamos una combinación de valores binarios que permite distinguir entre numerosas especies de ARN.

La detección de ARN de molécula única en profundidad mediante reacción en cadena de hibridación ( smHCR) es una técnica avanzada de seqFISH que puede superar la complicación típica del fondo autofluorescente en muestras de tejido gruesas y opacas. ^{[ 50 ]} En este método, múltiples sondas de lectura se unen a la región objetivo del ARNm. ^{[ 50 ]} El objetivo se detecta mediante un conjunto de sondas de ADN cortas que se unen a él en una subsecuencia definida. ^{[ 50 ]} Cada sonda de ADN lleva un iniciador para el mismo amplificador HCR. ^{[ 50 ]} Luego, las horquillas de ADN HCR marcadas con fluoróforo penetran en la muestra y se ensamblan en polímeros de amplificación fluorescentes que se unen a las sondas iniciadoras. ^{[ 50 ]} En estudios multiplexados, se utiliza el mismo protocolo de dos etapas descrito anteriormente: todos los conjuntos de sondas se introducen simultáneamente, al igual que todos los amplificadores HCR; se utilizan fluoróforos espectralmente distintos para la obtención de imágenes adicionales. ^{[ 50 ]}

La técnica Cyclic- o uroboros smFISH (osmFISH) es una adaptación de smFISH que busca superar el desafío del hacinamiento óptico. ^{[ 51 ]} En osmFISH, los transcritos se visualizan y se adquiere una imagen antes de que se elimine la sonda y se visualice un nuevo transcrito con una sonda fluorescente diferente. ^{[ 51 ]} Después de rondas sucesivas, las imágenes se compilan para ver la distribución espacial del ARN. ^{[ 51 ]} Debido a que los transcritos se visualizan secuencialmente, se elimina el problema de la interferencia de las señales entre sí. ^{[ 4 ] [ 51 ]} Este método permite al usuario generar imágenes de alta resolución de secciones de tejido más grandes que otras técnicas relacionadas. ^{[ 4 ]}

La técnica Expansion FISH (ExFISH) aprovecha la microscopía de expansión para permitir la obtención de imágenes de superresolución de la localización del ARN, incluso en muestras gruesas como el tejido cerebral. ^{[ 52 ]} Admite lecturas tanto de molécula única como multiplexadas. ^{[ 52 ]}

La hibridación in situ por fluorescencia iterativa asistida por expansión (EASI-FISH) optimiza y se basa en ExFISH con una precisión de detección mejorada y un procesamiento robusto de múltiples rondas en muestras más gruesas (300 μm) de lo que era posible anteriormente. ^{[ 53 ]} También incluye una plataforma de análisis computacional llave en mano. ^{[ 54 ]}

SeqFISH+ resolvió problemas ópticos relacionados con el hacinamiento espacial mediante rondas sucesivas de fluorescencia. ^{[ 55 ]} Primero, una sonda primaria se une al ARNm objetivo y luego las sondas subsiguientes se unen a las regiones flanqueantes de la sonda primaria, lo que da como resultado un código de barras único. ^{[ 55 ]} Cada sonda de lectura se captura como una imagen y se colapsa en una imagen de superresolución. ^{[ 55 ]} Este método permite al usuario dirigirse a hasta diez mil genes a la vez. ^{[ 4 ]}

La microscopía de ADN es un método de imagen distintivo para el mapeo sin óptica de las posiciones de las moléculas con preservación simultánea de los datos de secuenciación llevados a cabo en varias reacciones in situ consecutivas. ^{[ 56 ]} Primero, las células se fijan y se sintetiza el ADNc. ^{[ 56 ]} Luego, los nucleótidos aleatorios marcan los ADNc objetivo in situ , proporcionando etiquetas únicas para cada molécula. ^{[ 56 ]} Los transcritos marcados se amplifican en la segunda reacción in situ , las copias recuperadas se concatenan y se agregan nuevos nucleótidos aleatorios. ^{[ 56 ]} Cada evento de concatenación consecutivo se etiqueta, produciendo identificadores de evento únicos. ^{[ 56 ]} Luego, el algoritmo genera imágenes de los transcritos originales basándose en las proximidades moleculares decodificadas de las secuencias concatenadas obtenidas, mientras que también se registra la información de un solo nucleótido del objetivo. ^{[ 56 ]}

El método del candado ISS ^{[ 57 ]} se basa en el sondeo con candado, ^{[ 58 ]} la amplificación en círculo rodante (RCA), ^{[ 59 ]} y la secuenciación por química de ligación. ^{[ 60 ]} Dentro de secciones de tejido intactas, el ARNm se transcribe inversamente a ADNc, que es seguido por la degradación del ARNm por la RNasa H. ^{[ 4 ]} Luego, hay dos maneras en que se puede llevar a cabo este método. La primera manera, la secuenciación dirigida a huecos, implica la unión de la sonda de candado al ADNc con un hueco entre los extremos de la sonda que se dirigen a la secuenciación por ligación. ^{[ 4 ]} La polimerización del ADN luego llena este hueco y se crea un círculo de ADN por ligación de ADN. ^{[ 4 ]} Otra manera, la secuenciación dirigida a códigos de barras, la circularización del ADN de una sonda de candado con una secuencia de código de barras se lleva a cabo solo por ligación. ^{[ 4 ]} En ambas versiones del método, los extremos se ligan formando un círculo de ADN. ^{[ 4 ]} La amplificación del objetivo se realiza mediante RCA, obteniendo productos de RCA (RCP) de tamaño micrométrico. ^{[ 4 ]} Los RCA consisten en repeticiones de la secuencia de la sonda de candado. ^{[ 4 ]} Estas moléculas de ADN se someten a secuenciación por ligación, decodificando una secuencia rellena de huecos o un código de barras de hasta cuatro bases de longitud dentro de la sonda con extremos adyacentes, según la versión. ^{[ 4 ]} La variante sin huecos afirma tener mayor sensibilidad, mientras que la rellena de huecos implica la lectura de la secuencia de ARN real del transcrito. ^{[ 4 ]} Posteriormente, este método se mejoró mediante la automatización en una plataforma microfluídica y la sustitución de la secuenciación por ligación por la secuenciación por tecnología de hibridación. ^{[ 4 ]}

La secuenciación fluorescente in situ (FISSEQ), ^{[ 61 ]} como el candado ISS, es un método que utiliza técnicas de transcripción inversa, amplificación por círculo rodante y secuenciación por ligación. ^{[ 4 ]} Permite el análisis espacial del transcriptoma en células fijas. ^{[ 4 ]} El ARN se transcribe primero inversamente a ADNc con bases de amina regulares y modificadas y cebadores RT hexaméricos aleatorios marcados. ^{[ 4 ]} Las bases de amina median el entrecruzamiento del ADNc con su entorno celular. ^{[ 4 ]} Luego, el ADNc circula por ligación y se amplifica por RCA. ^{[ 4 ]}  Como resultado, se obtienen nanobolas de ADN monocatenario de 200–400 nm de diámetro. ^{[ 4 ]} Por lo tanto, estas nanobolas comprenden numerosas repeticiones en tándem de la secuencia de ADNc. Luego, la secuenciación se realiza mediante secuenciación SOLiD por ligación. ^{[ 4 ]} Las posiciones tanto del producto de la transcripción inversa como de los RCP amplificados clonalmente se mantienen mediante enlaces cruzados con los componentes de la matriz celular mencionados anteriormente, creando una biblioteca de RNA-seq in situ 3D dentro de la célula. ^{[ 4 ]} Una vez unidos a sondas fluorescentes de diferentes colores, los amplicones se vuelven altamente fluorescentes, lo que permite la detección visual de la señal; sin embargo, el algoritmo de procesamiento de imágenes se basa en la alineación de lecturas con secuencias de referencia en lugar de la intensidad de la señal. ^{[ 4 ]}

La secuenciación dirigida in situ mediante código de barras ( Barista-seq) es una mejora de la metodología de sondas de candado con huecos, que ofrece un aumento de cinco veces en la eficiencia, una longitud de lectura aumentada a quince bases y es compatible con las plataformas de secuenciación Illumina. [ ^{4 ] [ 39 ] El} método también utiliza sondas de candado y amplificación por círculo rodante; sin embargo, este enfoque utiliza secuenciación por síntesis y reticulación, a diferencia del método de candado con huecos. ^{[ 39 ]} La reticulación a la matriz celular en el mismo procedimiento es la misma que en FISSEQ. ^{[ 4 ] [ 39 ]}

El mapeo de lectura de amplicones de transcripción con resolución espacial ( STARmap) utiliza una sonda de candado con un cebador adicional que permite la amplificación directa del ARNm, prescindiendo de la transcripción inversa. ^{[ 4 ] [ 62 ]} De forma similar a otros métodos basados ​​en sondas de candado, la amplificación se produce mediante amplificación en círculo rodante. ^{[ 4 ]} Los amplicones de ADN se modifican químicamente y se incrustan en un hidrogel polimerizado dentro de la célula. ^{[ 4 ]} El ARN capturado puede luego secuenciarse in situ, proporcionando ubicaciones tridimensionales del ARNm dentro de cada célula. ^{[ 4 ]}

STOmics es pionera en el avance del análisis transcriptómico con resolución espacial mediante su tecnología patentada SpaTial Enhanced REsolution Omics-Sequencing (Stereo-seq). ^{[ 63 ]} Combina la captura in situ con DNB-seq. La secuenciación DNB se basa en chips grabados litográficamente (matrices con patrones) para la secuenciación in situ . A diferencia de otras tecnologías de captura in situ a nivel micrométrico , los chips DNB estándar tienen puntos con  un diámetro aproximado de 220 nm y una distancia entre centros de 500  nm, lo que proporciona hasta 20 000 puntos para la captura de ARN tisular por cada 10 mm de distancia lineal, o 4 × 10⁸ ^puntos por 1 ^cm²  . Por lo tanto, STOmics puede mostrar una mayor resolución y un campo de visión más amplio que otras tecnologías de captura in situ . ^{[ 64 ]}

El primer método ampliamente adoptado fue descrito por Ståhl et al. en un artículo fundamental de 2016 en Science, ^{[ 14 ]} acuñando el término "transcriptómica espacial". Esta metodología se basa en la difusión de ARNm desde una sección de tejido fresco congelado para la captura de los ARNm poliadenilados mediante hibridación a una secuencia de oligo(dT) unida a un portaobjetos de vidrio. ^{[ 14 ]} El portaobjetos de vidrio está dispuesto con "puntos" que contienen la secuencia de oligo(dT) para capturar los transcritos de ARNm, una secuencia de código de barras espacial para indicar la posición x e y en el portaobjetos dispuesto, un controlador de amplificación y secuenciación para generar bibliotecas de secuencias y un identificador molecular único para cuantificar la abundancia de transcritos. ^{[ 14 ]} Las muestras de tejido congelado se cortan con un criótomo , luego se fijan, se tiñen y se colocan cuidadosamente planas sobre el microarreglo. ^{[ 14 ]} A continuación, la permeabilización enzimática permite que las moléculas de ARN se difundan hacia el portaobjetos del microarreglo para la hibridación de moléculas de ARNm poliadenilado con las colas de la secuencia oligo(dT). ^{[ 14 ]} Luego se lleva a cabo la transcripción inversa in situ para la síntesis de la primera cadena. ^{[ 14 ]} Como resultado, se sintetiza ADN complementario (ADNc) marcado espacialmente, lo que proporciona información sobre la expresión génica en la ubicación exacta de la sección de tejido. ^{[ 14 ]} A partir del ADNc, se generan bibliotecas para la secuenciación de lectura corta. En resumen, este protocolo de transcriptómica espacial combina la secuenciación paralela y la tinción de la misma muestra. ^{[ 14 ]} En el análisis posterior, las herramientas bioinformáticas permiten superponer la imagen del tejido con la expresión génica. El resultado es un mapa de la expresión génica capturada del transcriptoma dentro de una sección de tejido. Es importante mencionar que la primera generación de portaobjetos en matriz comprendía alrededor de 1000 puntos de 100 μm de diámetro, lo que limitaba la resolución a ~10-40 células por punto. ^{[ 14 ]}

Esta tecnología fue la base de una empresa fundada en 2012 llamada Spatial Transcriptomics. En 2018, 10X Genomics adquirió Spatial Transcriptomics ^{[ 65 ]} como base para la plataforma 10X Visium.

Slide-seq se basa en la unión de microesferas con código de barras de ADN que se unen al ARN a un cubreobjetos de vidrio recubierto de goma. ^{[ 4 ] [ 17 ]} Las microesferas se localizan espacialmente mediante secuenciación SOLiD. ^{[ 17 ]} Las secciones de tejido se transfieren a este cubreobjetos para capturar el ARN extraído. El ARN capturado se amplifica y secuencia. ^{[ 17 ]} La localización del transcrito se determina mediante la secuencia de oligonucleótidos del código de barras de la microesfera que lo capturó. ^{[ 17 ]}

APEX-seq permite evaluar el transcriptoma espacial en diferentes regiones de una célula. ^{[ 4 ] [ 66 ]} El método utiliza el gen APEX2, expresado en células vivas que se incuban con biotina-fenol y peróxido de hidrógeno. ^{[ 66 ]} En estas condiciones, las enzimas APEX2 catalizan la transferencia de grupos biotina a las moléculas de ARN, las cuales pueden purificarse mediante purificación con perlas de estreptavidina. ^{[ 66 ]} Los transcritos purificados se secuencian para determinar qué moléculas se encontraban cerca de la enzima de marcaje con biotina. ^{[ 66 ]}

La transcriptómica espacial de alta definición ( HDST ) comienza con la decodificación de la ubicación de las microesferas de captura de ARNm en pocillos de un portaobjetos de vidrio. ^{[ 67 ]} Esto se logra mediante hibridación secuencial con la secuencia de oligonucleótidos del código de barras de cada microesfera. ^{[ 67 ]} Una vez decodificada la ubicación de cada microesfera, se puede colocar una muestra de tejido en el portaobjetos y permeabilizarla. ^{[ 67 ]} Luego se secuencian los transcritos capturados. ^{[ 67 ]} HDST utiliza microesferas más pequeñas que Slide-seq y, por lo tanto, puede resolverse a una resolución espacial de dos micrómetros en comparación con los diez micrómetros de Slide-seq. ^{[ 4 ]}

El ensayo Visium de 10X Genomics es una versión más reciente y mejorada del ensayo de transcriptómica espacial. También utiliza matrices de sondas de captura de ARNm en la superficie de portaobjetos de vidrio, pero con un mayor número de puntos, un tamaño de punto minimizado y una mayor cantidad de sondas de captura por punto. Dentro de cada una de las cuatro áreas de captura de los portaobjetos de expresión génica espacial Visium, hay aproximadamente 5000 puntos con código de barras, que a su vez contienen millones de oligonucleótidos de captura con código de barras espacial. El ARNm del tejido se libera tras la permeabilización y se une a los oligonucleótidos con código de barras, lo que permite la captura de información sobre la expresión génica. Cada punto con código de barras tiene  un diámetro de 55 μm, y la distancia entre el centro de un punto y el centro de otro es de aproximadamente 100  μm. Los puntos están escalonados para minimizar la distancia entre ellos. En promedio, se captura ARNm de entre 1 y 10 células por punto, lo que proporciona una resolución cercana a la de una sola célula. ^{[ 68 ]}

ElEl ensayo es similar en concepto al 10X Genomics Visium, pero presenta una mayor densidad de puntos. A diferencia del 10X Genomics Visium HD, que utiliza sondas de ARN que deben predefinirse para especies como la humana o la del ratón, SEEKER ofrece una densidad y resolución similares, pero analiza cualquier muestra de tejido fresco congelado, mediante la adaptación de poliadenilación de todos los ARNm de la muestra.

La reconstrucción espacial in silico con ISH implica la reconstrucción espacial computacional de las ubicaciones de las células según sus perfiles de expresión. ^{[ 4 ]} Existen varios métodos similares a este principio. ^{[ 69 ] [ 70 ]} Co-analizan la transcriptómica de células individuales y los atlas de expresión génica basados ​​en ISH disponibles del mismo tipo de célula. ^{[ 4 ]} Con base en estos datos, las células se asignan a sus posiciones en el tejido. Obviamente, este método está limitado por el factor de disponibilidad de referencias de ISH. ^{[ 4 ]} Además, se vuelve más complicado cuando se asignan células en tejidos complejos. Este enfoque no es aplicable para muestras clínicas debido a la falta de referencias emparejadas. ^{[ 4 ]} La tasa de éxito reportada para la asignación exacta de células en tejido cerebral fue del 81%. ^{[ 69 ]}

El mapeo del transcriptoma mediante el algoritmo Distmap requiere secuenciación de células individuales de alto rendimiento y un atlas de hibridación in situ existente para el tejido de interés. ^{[ 4 ] [ 71 ]} El algoritmo Distmap genera un modelo 3D virtual del tejido de interés utilizando los transcriptomas de las células secuenciadas y dicho atlas de referencia. ^{[ 4 ] [ 71 ]} Los transcriptomas se pueden agrupar en tipos de células utilizando incrustación estocástica de vecinos distribuidos en t y mapear al modelo 3D utilizando hibridación in situ virtual. ^{[ 71 ] [ 72 ]} Esencialmente, este algoritmo toma datos generados de células individuales en un tejido disociado y es capaz de mapear transcripciones individuales a donde existe el tipo de célula en el tejido utilizando hibridación in situ virtual.