ChIA-PET

El análisis de interacción de cromatina mediante secuenciación de etiquetas de extremos apareados ( ChIA-PET o ChIA-PETS ) es una técnica de biología molecular que incorpora enriquecimiento basado en inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), ligación de proximidad de cromatina , etiquetas de extremos apareados y secuenciación de alto rendimiento para determinar interacciones de cromatina de largo alcance de novo en todo el genoma. ^{[ 1 ]}

Los genes pueden ser regulados por regiones alejadas del promotor, como elementos reguladores, aisladores, elementos de frontera y sitios de unión de factores de transcripción (TFBS) . Descubrir la interacción entre las regiones reguladoras y las regiones codificantes de genes es fundamental para comprender los mecanismos que rigen la regulación génica en la salud y la enfermedad (Maston et al., 2006). La técnica ChIA-PET permite identificar interacciones de cromatina funcionales y únicas entre los sitios de unión de factores de transcripción reguladores distales y proximales y los promotores de los genes con los que interactúan.

La técnica ChIA-PET también puede utilizarse para desentrañar los mecanismos de control del genoma durante procesos como la diferenciación , la proliferación y el desarrollo celular . Al crear mapas de interactoma ChIA-PET para proteínas reguladoras de unión al ADN y regiones promotoras , podemos identificar mejor objetivos específicos para la intervención terapéutica (Fullwood y Yijun, 2009).

El método ChIA-PET combina métodos basados ​​en ChIP, ^{[ 2 ]} y métodos basados ​​en la captura de conformación cromosómica (3C), ^{[ 3 ]} para extender las capacidades de ambos enfoques. La secuenciación ChIP (ChIP-Seq) es un método popular utilizado para identificar sitios de unión de factores de transcripción (TFBS), mientras que 3C se ha utilizado para identificar interacciones de cromatina de largo alcance. Independientemente, ambos sufren limitaciones para identificar interacciones de largo alcance de novo en todo el genoma. Si bien ChIP-Seq puede identificar TFBS en todo el genoma, ^{[ 4 ] [ 5 ]} solo proporciona información lineal de los sitios de unión de proteínas a lo largo de los cromosomas (pero no interacciones entre ellos), y puede sufrir un alto ruido de fondo genómico (falsos positivos). Si bien 3C es capaz de analizar interacciones de cromatina no lineales de largo alcance, no se puede utilizar en todo el genoma y, al igual que ChIP-Seq, también sufre altos niveles de ruido de fondo. Dado que el ruido aumenta en relación con la distancia entre las regiones interactuantes (máximo 100 kb), se requieren controles laboriosos y tediosos para una caracterización precisa de las interacciones de la cromatina. ^{[ 6 ]} A diferencia de 3C, que es un método de perfilado de interacciones específico de locus, se han establecido métodos alternativos como Hi-C para perfilar interacciones en todo el genoma. ^{[ 7 ]} A pesar de los métodos de perfilado de todo el genoma para TFBS e interacciones de largo alcance, la combinación de enfoques con el método ChIA-PET permite la identificación de áreas genómicas en las que se une la proteína de interés, así como la región genómica con la que interactúa. ^{[ 8 ] [ 9 ]}

El método ChIA-PET resuelve con éxito los problemas de ruido de interacción no específica que se encuentran en ChIP-Seq mediante la sonicación de los fragmentos ChIP para separar las uniones aleatorias de los complejos de interacción específicos. El siguiente paso, denominado enriquecimiento, reduce la complejidad del análisis genómico y añade especificidad a las interacciones de la cromatina unidas por factores de transcripción (FT) predeterminados. La capacidad de los enfoques 3C para identificar interacciones de largo alcance se basa en la teoría de la ligación por proximidad. En lo que respecta a la interligación del ADN, los fragmentos unidos por complejos proteicos comunes presentan mayores ventajas cinéticas en condiciones de baja concentración que aquellos que se difunden libremente en solución o se anclan en diferentes complejos. ChIA-PET aprovecha este concepto incorporando secuencias de enlace en los extremos libres de los fragmentos de ADN unidos a los complejos proteicos. Para generar conectividad entre los fragmentos unidos por complejos reguladores, las secuencias de enlace se ligan durante la ligación nuclear por proximidad. Por lo tanto, los productos de la ligación conectada por enlazadores pueden analizarse mediante secuenciación PET de ultra alto rendimiento y mapearse al genoma de referencia . Dado que ChIA-PET no depende de sitios específicos para la detección como 3C y 4C, permite la detección de novo imparcial de interacciones de cromatina en todo el genoma. ^{[ 8 ]} En comparación con Hi-C, el uso de un pulldown de anticuerpos limita el número de fragmentos secuenciados a las interacciones de cromatina unidas por la proteína de interés, lo que también puede facilitar el análisis de datos.

Parte del flujo de trabajo que se realiza en laboratorio húmedo:

• El formaldehído se utiliza para reticular los complejos ADN-proteína. La sonicación se utiliza para romper la cromatina y también para reducir las interacciones no específicas.
• Se utiliza un anticuerpo específico para enriquecer los fragmentos de cromatina unidos a la proteína de interés. El material ChIP unido por el anticuerpo se utiliza para construir la ChIA-PET.
• Figura 1. Se utilizan semienlazadores de oligonucleótidos biotinilados que contienen sitios MmeI flanqueantes para conectar fragmentos de ADN ligados por proximidad. Se diseñan dos enlazadores diferentes (A y B) con códigos de barras de nucleótidos específicos (CG o AT) para cada una de las dos secuencias de enlazador (esto permitirá la identificación del producto de ligación quimérico como se describe en la Figura 5).
• Figura 2. Los enlazadores están ligados a los fragmentos de ADN unidos.
• Figura 3. Los fragmentos enlazadores se ligan a las perlas ChIP en condiciones de baja concentración. A continuación, el ADN purificado se digiere con MmeI, que corta a cierta distancia de su sitio de reconocimiento para liberar la estructura etiqueta-enlazador-etiqueta.
• Figura 4. Los PET biotinilados se inmovilizan posteriormente en microesferas magnéticas conjugadas con estreptavidina.
• Figura 5. Las secuencias PET con composición de código de barras de enlace AA (CG/CG) y BB (AT/AT) se consideran posibles productos de ligación intracomplejo, mientras que las secuencias PET con composición de enlace AB (CG/AT) se consideran derivadas de productos de ligación quiméricos entre fragmentos de ADN unidos en diferentes complejos de cromatina.

Parte del flujo de trabajo correspondiente al laboratorio seco:

Extracción, mapeo y análisis estadísticos de PET

Las etiquetas PET se extraen y se mapean al genoma humano de referencia in silico .

Identificación de picos enriquecidos mediante ChIP (sitios de unión)

Las PET autoligadas se utilizan para identificar sitios enriquecidos de ChIP porque proporcionan el mapeo más fiable (20 + 20 bit/s) al genoma de referencia.

Algoritmo de detección de picos de enriquecimiento de ChIP

Se considera que un pico detectado es un sitio de unión si existen múltiples PET autoligados superpuestos. La tasa de falsos descubrimientos (FDR) se determina mediante simulaciones estadísticas para estimar el fondo aleatorio de superposiciones de ADN virtual derivadas de PET y el ruido de fondo estimado.

Filtrado de ADN repetitivo (afecta a la unión no específica)

Se eliminan las regiones satélite y los sitios de unión presentes en regiones con variaciones estructurales severas.

Recuento de enriquecimiento de ChIP

En cada sitio se registran las cantidades de PETs de autoligación e interligación (dentro de una ventana de +250 pb). El número total de PETs de autoligación e interligación en un sitio específico se denomina recuento de enriquecimiento de ChIP.

Figura 6. Clasificación PET: Las secuencias PET alineadas de forma única se pueden clasificar según se deriven de un fragmento de ADN o de dos fragmentos de ADN.

• PET de autoligado

Si las dos etiquetas de un PET se localizan en el mismo cromosoma con una extensión genómica dentro del rango de los fragmentos de ADN de ChIP (menos de 3 Kb), con la orientación de autoligación esperada y en la misma hebra, se consideran derivadas de una autoligación de un único fragmento de ADN de ChIP y se consideran un PET de autoligación.

• PET de interligación

Si un PET no cumple con estos criterios, lo más probable es que sea el resultado de la ligación de dos fragmentos de ADN y se denomina PET de interligación. Las dos etiquetas de un PET de interligación no tienen una orientación fija, pueden no encontrarse en las mismas hebras, pueden abarcar cualquier segmento genómico y pueden no estar mapeadas en el mismo cromosoma.

• PET de interligación intracromosómica

Si las dos etiquetas de un PET de interligación se localizan en el mismo cromosoma, pero con una extensión superior a 3 kb en cualquier orientación, entonces estos PET se denominan PET de interligación intracromosómicos.

• PET de interligación intercromosómica

Los PET que se localizan en cromosomas diferentes se denominan PET de interligación intercromosómica.

Figura 7. Mecanismo propuesto que muestra cómo los elementos reguladores distales pueden iniciar interacciones de cromatina de largo alcance que involucran regiones promotoras de genes diana.

Las interacciones forman estructuras de bucles de ADN con múltiples sitios de unión a factores de transcripción (TFBS) en el centro de anclaje. Los bucles pequeños podrían empaquetar genes cerca del centro de anclaje en un subcompartimento estrecho, lo que aumentaría la concentración local de proteínas reguladoras para una mayor activación transcripcional. Este mecanismo también podría mejorar la eficiencia de la transcripción, permitiendo que la ARN polimerasa II recicle las plantillas génicas circulares estrechas. Los bucles de interacción grandes tienen más probabilidades de unir genes distantes en ambos extremos del bucle, ubicados cerca de los sitios de anclaje para una regulación coordinada, o podrían separar genes en bucles largos para evitar su activación. Adaptado de Fullwood et al. (2009).

Ventajas del método ChIA-PET

• ChIA-PET tiene el potencial de ser un enfoque imparcial, de genoma completo y de novo para el análisis de interacciones de cromatina de largo alcance (Fullwood y Yijun, 2009).
• Un experimento ChIA-PET es capaz de proporcionar dos conjuntos de datos globales: los sitios de unión del factor proteico (PET autoligados) y las interacciones entre los sitios de unión (PET interligados).
• La técnica ChIA-PET utiliza ChIP para reducir la complejidad del análisis genómico y añade especificidad a las interacciones de la cromatina unidas por factores de interés específicos.
• ChIA-PET es compatible con métodos de secuenciación de próxima generación basados ​​en etiquetas, como la pirosecuenciación Roche 454 , Illumina GA, ABI SOLiD y Helicos.
• La técnica ChIA-PET es aplicable a muchos factores proteicos diferentes implicados en la regulación transcripcional o en la conformación estructural de la cromatina.
• El análisis ChIA-PET puede aplicarse a las interacciones de la cromatina implicadas en un proceso nuclear específico. Mediante el uso de factores de transcripción generales, como la ARN polimerasa II , es posible identificar todas las interacciones de la cromatina involucradas en la regulación de la transcripción. Además, el uso de factores proteicos implicados en la replicación del ADN o la estructura de la cromatina permitiría identificar todas las interacciones debidas a la replicación del ADN y la modificación estructural de la cromatina (Fullwood et al., 2009).

Debilidades

• Está bien establecido que los complejos reguladores cis y trans contienen combinaciones únicas de proteínas según las condiciones específicas de cada célula y tejido (Dekker et al., 2006). Si bien la identificación de sitios de unión a factores de transcripción (TFBS) funcionales individuales representa un avance significativo, el uso de ChIA-PET para identificar proteínas individuales en un complejo requeriría conjeturas y múltiples experimentos para identificar cada proteína interactuante. Esto sería una tarea costosa y que consumiría mucho tiempo.
• La técnica ChIA-PET está limitada por la calidad, pureza y especificidad de los anticuerpos utilizados (Fullwood et al., 2009).
• La técnica ChIA-PET depende de la identificación de secuencias que puedan mapearse a la secuencia de referencia (ref).
• La técnica ChIA-PET requiere el uso de algoritmos informáticos de detección de picos para organizar y mapear las lecturas PET al genoma de referencia. Debido a las variaciones entre las plataformas de software, los resultados pueden variar según el programa utilizado.
• Aunque las regiones de ADN repetitivo pueden estar asociadas con la regulación genética (Polak y Domany, 2006), deben eliminarse ya que pueden afectar los datos (Fullwood et al., 2009).
• El enriquecimiento a partir de dos sitios simultáneamente introduce un sesgo en contra de las regiones circundantes. ^{[ 10 ]}

Fullwood et al. (2009) utilizaron ChIA-PET para detectar y mapear la red de interacción de la cromatina mediada por el receptor de estrógeno alfa (ER-alfa) en células cancerosas humanas. El mapa global del interactoma de la cromatina resultante reveló que los sitios de unión de ER-alfa distantes también estaban anclados a los promotores de genes a través de interacciones de cromatina de largo alcance, lo que sugiere que ER-alfa funciona mediante un extenso bucle de cromatina para acercar los genes y lograr una regulación transcripcional coordinada.

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