Identificación de la ADN adenina metiltransferasa

La N6-metiladenina (m6A) es el producto de la adición de un grupo metilo (CH3 ₎ en la posición 6 de la adenina. Este nucleótido modificado está ausente en la gran mayoría de los eucariotas, con la excepción de C. elegans , ^{[ 3 ]} pero está ampliamente distribuido en los genomas bacterianos, ^{[ 4 ]} como parte de los sistemas de modificación de restricción o reparación del ADN . En Escherichia coli , la metilación de la adenina es catalizada por la adenina metiltransferasa Dam (ADN adenina metiltransferasa), que cataliza la metilación de la adenina exclusivamente en la secuencia palindrómica GATC. La expresión ectópica de Dam en células eucariotas conduce a la metilación de la adenina en secuencias GATC sin ningún otro efecto secundario notable.

En base a esto, DamID consiste en fusionar Dam a una proteína de interés (generalmente una proteína que interactúa con el ADN, como los factores de transcripción ) o a un componente de la cromatina. De esta forma, la proteína de interés dirige a Dam a su sitio de unión in vivo específico , lo que da como resultado la metilación de los GATC vecinos. La presencia de m6A, que coincide con los sitios de unión de las proteínas de interés, se detecta mediante PCR de metilación .

En este ensayo, el genoma se digiere con DpnI , enzima que corta únicamente los GATC metilados. A continuación, se ligan adaptadores de doble cadena con una secuencia conocida a los extremos generados por DpnI. Los productos de la ligación se digieren con DpnII , enzima que corta los GATC no metilados, asegurando que solo se amplifiquen en la PCR posterior los fragmentos flanqueados por GATC metilados consecutivos . Posteriormente, se realiza una PCR con cebadores que coinciden con los adaptadores, lo que da lugar a la amplificación específica de los fragmentos genómicos flanqueados por GATC metilados.

La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método alternativo para analizar la unión de proteínas en loci específicos del genoma. A diferencia de ChIP, DamID no requiere un anticuerpo específico contra la proteína de interés. Por un lado, esto permite mapear proteínas para las que no se dispone de dicho anticuerpo. Por otro lado, imposibilita el mapeo específico de proteínas modificadas postraduccionalmente .

Otra diferencia fundamental es que los ensayos ChIP analizan la proteína de interés en un momento dado, mientras que los ensayos DamID la analizan cuando ya ha pasado . La razón es que la m6A permanece en el ADN después de que la proteína de fusión Dam desaparece. Para las proteínas que están unidas o no a sus sitios diana, esto no cambia el panorama general. Sin embargo, esto puede generar grandes diferencias en el caso de proteínas que se deslizan a lo largo del ADN ( por ejemplo, la ARN polimerasa ).

Dependiendo de cómo se lleve a cabo el experimento, DamID puede estar sujeto a sesgos de metilación de plásmidos. Dado que los plásmidos generalmente se amplifican en E. coli , donde Dam se expresa naturalmente, se metilan en cada GATC. En experimentos de transfección transitoria , el ADN de esos plásmidos se recupera junto con el ADN de las células transfectadas, lo que significa que se amplifican fragmentos del plásmido en la PCR de metilación. Por lo tanto, cualquier secuencia del genoma que comparta homología o identidad con el plásmido puede parecer que está unida a la proteína de interés. En particular, esto sucede con el marco de lectura abierto de la proteína de interés, que está presente tanto en el plásmido como en el genoma. En experimentos de microarrays , este sesgo puede utilizarse para asegurar que el material correcto se haya hibridado. En líneas celulares estables o animales totalmente transgénicos, este sesgo no se observa, ya que no se recupera ADN plasmídico.

Las células apoptóticas degradan su ADN siguiendo un patrón característico de escalera de nucleosomas . Esto genera fragmentos de ADN que pueden ligarse y amplificarse durante el procedimiento DamID (laboratorio de van Steensel, observaciones no publicadas). Se desconoce la influencia de estos fragmentos nucleosomales en el perfil de unión de una proteína.

La resolución de DamID depende de la disponibilidad de secuencias GATC en el genoma. Una proteína solo puede mapearse dentro de dos sitios GATC consecutivos. El espaciamiento medio entre fragmentos GATC es de 205 pb en Drosophila (FlyBase versión 5), 260 en ratón (Mm9) y 460 en humano (HG19). Se puede utilizar un protocolo modificado (DamIP), que combina la inmunoprecipitación de m6A con una variante de Dam con reconocimiento de sitio diana menos específico, para obtener datos de mayor resolución. ^{[ 5 ]}

El método DamID dirigido (TaDa) utiliza el fenómeno de reiniciación ribosómica para expresar proteínas de fusión Dam en niveles adecuadamente bajos para DamID (es decir, Dam no es saturante, evitando así la toxicidad). Este constructo puede combinarse con promotores específicos de tipo celular, lo que resulta en metilación específica de tejido. ^{[ 6 ] [ 7 ]} Este método puede utilizarse para analizar la unión de factores de transcripción en un tipo celular de interés o, alternativamente, Dam puede fusionarse a subunidades de Pol II para determinar la unión de la ARN polimerasa y, por lo tanto, inferir la expresión génica específica de la célula. Se ha demostrado la eficacia de DamID dirigido en células de Drosophila y ratón ^{[ 8 ] [ 9 ]} .

La identificación celular específica de Dam también puede lograrse mediante la escisión mediada por recombinación de un casete terminador transcripcional ubicado corriente arriba de la proteína de fusión Dam. ^{[ 10 ]} El casete terminador está flanqueado por sitios de recombinación FRT que pueden eliminarse al combinarse con la expresión tisular específica de la recombinasa FLP . Tras la eliminación del casete, la proteína de fusión Dam se expresa a niveles bajos bajo el control de un promotor basal.

Este método puede utilizarse para detectar la unión simultánea de dos factores al mismo locus genómico . La metilasa Dam puede expresarse en dos mitades fusionadas a diferentes proteínas de interés. Cuando ambas proteínas se unen a la misma región del ADN, la enzima Dam se reconstituye y puede metilar los sitios GATC circundantes. ^{[ 11 ]}

Debido a la alta actividad de la enzima, la expresión de Dam no ligada produce la metilación de todas las regiones de cromatina accesible. ^{[ 12 ] [ 13 ]} Este enfoque puede utilizarse como alternativa a ATAC-seq o DNAse-seq . Al combinarse con métodos DamID específicos para cada tipo celular, la expresión de Dam no ligada puede utilizarse para identificar regiones promotoras o potenciadoras específicas de cada tipo celular.

Una variante de DamID, conocida como RNA-DamID, puede utilizarse para detectar interacciones entre moléculas de ARN y ADN. ^{[ 14 ]} Este método se basa en la expresión de una proteína de fusión Dam-MCP, capaz de unirse a un ARN modificado con bucles de tallo MS2 . La unión de la proteína de fusión Dam al ARN produce una metilación detectable en los sitios de unión del ARN al genoma.

Las secuencias de ADN distales a un sitio de unión de proteínas pueden acercarse físicamente mediante el plegamiento de los cromosomas. Por ejemplo, estas interacciones median la función de los potenciadores y promotores . Estas interacciones pueden detectarse mediante la metilación de Dam. Si Dam se dirige a un locus de ADN específico conocido, los sitios distales que se aproximan debido a la configuración tridimensional del ADN también se metilarán y podrán detectarse como en la identificación de Dam convencional. ^{[ 15 ]}

DamID se suele realizar en unas 10 000 células ^{[ 16 ]} (aunque se ha demostrado su eficacia con menos ^{[ 6 ]} ). Esto significa que los datos obtenidos representan la unión promedio, o la probabilidad de un evento de unión en esa población celular. También se ha desarrollado un protocolo DamID para células individuales y se ha aplicado a células humanas ^{[ 17 ]} . Los enfoques de célula única pueden resaltar la heterogeneidad de las asociaciones de cromatina entre células.