chip de inmunoprecipitación de ARN

RIP-chip (chip de inmunoprecipitación de ARN) es una técnica de biología molecular que combina la inmunoprecipitación de ARN con un microarreglo . El propósito de esta técnica es identificar qué secuencias de ARN interactúan con una proteína de unión a ARN de interés in vivo . ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]} También se puede utilizar para determinar los niveles relativos de expresión génica , para identificar subconjuntos de ARN que pueden estar corregulados o para identificar ARN que pueden tener funciones relacionadas. ^{[ 4 ] [ 5 ]} Esta técnica proporciona información sobre la regulación génica postranscripcional que ocurre entre el ARN y las proteínas de unión a ARN. ^{[ 5 ]}

1. Recolectar y lisar las células de interés .
2. Aísle de la solución todos los fragmentos de ARN y las proteínas unidas a ellos.
3. Inmunoprecipita la proteína de interés. La solución que contiene los ARN unidos a la proteína se lava sobre microesferas conjugadas con anticuerpos . Estos anticuerpos están diseñados para unirse a la proteína de interés y la extraen de la solución, que contiene el resto del contenido celular, junto con cualquier fragmento de ARN unido específicamente a ella.
4. Disocie el ARN unido a la proteína del complejo anticuerpo-microesfera . A continuación, utilice una centrífuga para separar el ARN unido a la proteína de los complejos anticuerpo-microesfera más pesados, conservando el ARN unido a la proteína y desechando las microesferas.
5. Disociar el ARN de la proteína de interés .
6. Aísle los fragmentos de ARN de la proteína mediante centrifugación.
7. Utilice la PCR de transcripción inversa para convertir los fragmentos de ARN en ADNc (ADN complementario a los fragmentos de ARN).
8. Marcar fluorescentemente estos fragmentos de ADNc.
9. Prepare el chip genético . Se trata de un pequeño chip con secuencias de ADN unidas en ubicaciones conocidas. Estas secuencias corresponden a todos los genes conocidos del genoma del organismo con el que trabaja el investigador (o a un subconjunto de genes de su interés). Las secuencias de ADNc recolectadas serán complementarias a algunas de estas secuencias de ADN, ya que representan un subconjunto de los ARN transcritos a partir del genoma.
10. Permitir que los fragmentos de ADNc se hibriden de forma competitiva con las secuencias de ADN unidas al chip .
11. La detección de la señal fluorescente del ADNc unido al chip indica a los investigadores qué gen(es) del chip se hibridaron con el ADNc.

Los genes identificados mediante fluorescencia en el análisis de microarrays son aquellos cuyo ARN interactúa con la proteína de interés original. La intensidad de la señal fluorescente de un gen específico indica la cantidad de ese ARN presente en la muestra original, lo que a su vez indica el nivel de expresión de dicho gen.

Las técnicas previas destinadas a comprender las interacciones proteína-ARN incluían ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética de ARN y reticulación UV seguida de RT-PCR, ^{[ 9 ]} sin embargo, este análisis selectivo no se puede utilizar cuando aún se desconocen los ARN unidos. ^{[ 1 ]} Para resolver esto, RIP-chip combina la inmunoprecipitación de ARN para aislar moléculas de ARN que interactúan con proteínas específicas con un microarreglo que puede dilucidar la identidad de los ARN que participan en esta interacción. ^{[ 5 ] [ 1 ]} Las alternativas a RIP-chip incluyen:

• RIP-seq : Implica la secuenciación de los ARN que se precipitaron utilizando secuenciación de alto rendimiento en lugar de analizarlos con un microarreglo. ^{[ 5 ]} Los autores Zhao et al., 2010. ^{[ 10 ]} combinaron el procedimiento de inmunoprecipitación de ARN con la secuenciación de ARN . Utilizando anticuerpos específicos (α-Ezh2) inmunoprecipitaron el ARN nuclear aislado de células ES de ratón y posteriormente secuenciaron el ARN precipitado utilizando la plataforma de secuenciación de próxima generación , Illumina. ^{[ 10 ]}
• CLIP : La proteína de unión al ARN se une al ARN mediante luz UV antes de la lisis, seguida de fragmentación del ARN, inmunoprecipitación, lavado con alta concentración de sal, SDS-PAGE , transferencia a membrana, digestión con proteinasa, preparación de bibliotecas de ADNc y secuenciación para identificar los sitios de unión directa al ARN. ^{[ 11 ]} CLIP se combinó por primera vez con secuenciación de alto rendimiento en HITS-CLIP para determinar los sitios de unión de Nova-ARN en el cerebro de ratón, ^{[ 12 ]} y en iCLIP que permitió la amplificación de ADNc truncados e introdujo el uso de UMIs. ^{[ 13 ]}
• ChIP-on-chip : Una técnica similar que detecta la unión de proteínas al ADN genómico en lugar de al ARN. ^{[ 14 ]}