iCLIP

iCLIP ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} (entrecruzamiento e inmunoprecipitación con resolución de nucleótidos individuales) es una variante del método CLIP original utilizado para identificar interacciones proteína-ARN, ^{[ 4 ]} que utiliza luz UV para unir covalentemente proteínas y moléculas de ARN para identificar sitios de unión de ARN de proteínas. Este paso de entrecruzamiento tiene generalmente menos ruido de fondo que los protocolos estándar de inmunoprecipitación de ARN (RIP), porque el enlace covalente formado por la luz UV permite que el ARN se fragmente, seguido de una purificación rigurosa, y esto también permite que CLIP identifique las posiciones de las interacciones proteína-ARN. ^{[ 5 ]} Al igual que con todos los métodos CLIP , iCLIP permite una purificación muy rigurosa de los complejos proteína-ARN unidos mediante lavado riguroso durante la inmunoprecipitación seguido de SDS-PAGE y transferencia a nitrocelulosa . Los complejos proteína-ARN marcados se visualizan para el control de calidad, se extraen de la nitrocelulosa y se tratan con proteinasa para liberar el ARN, dejando solo unos pocos aminoácidos en el sitio de entrecruzamiento del ARN. ^{[ 6 ]}

El ARN se transcribe inversamente, lo que provoca que la mayoría de los ADNc se trunquen en el sitio de entrecruzamiento. La innovación clave y la característica única del desarrollo de iCLIP fue permitir la amplificación por PCR y la secuenciación de dichos ADNc truncados mediante una plataforma de secuenciación de nueva generación. iCLIP también añadió una secuencia aleatoria (identificador molecular único, UMI ) junto con códigos de barras experimentales al cebador utilizado para la transcripción inversa, codificando así los ADNc únicos para minimizar cualquier error o sesgo cuantitativo de la PCR y, por lo tanto, mejorando la cuantificación de los eventos de unión. La amplificación de los ADNc truncados permitió la identificación de los sitios de interacción ARN-proteína con alta resolución mediante el análisis de la posición inicial de los ADNc truncados, así como su cuantificación precisa utilizando UMI con el software " iCount ". ^{[ 1 ]} Todas estas innovaciones de iCLIP fueron adoptadas por variantes posteriores de CLIP ^{[ 6 ]} como eCLIP ^{[ 7 ]} e irCLIP. ^{[ 8 ]} Un enfoque adicional para identificar sitios de entrecruzamiento proteína-ARN es el análisis mutacional de ADNc de lectura continua, como transiciones de nucleótidos en PAR-CLIP , ^{[ 9 ]} u otros tipos de errores que pueden ser introducidos por la transcriptasa inversa cuando lee a través del sitio de entrecruzamiento en el método HITS-CLIP estándar con el análisis del sitio de mutación inducida por entrecruzamiento (CIMS). ^{[ 10 ]}

La naturaleza cuantitativa de iCLIP permitió comparaciones pioneras entre muestras a nivel de ARN completos, ^{[ 11 ]} o estudiar la unión competitiva de múltiples proteínas de unión a ARN ^{[ 12 ]} o cambios sutiles en la unión de una proteína mutante a nivel de picos de unión. ^{[ 13 ]} Recientemente se desarrolló una variante mejorada de iCLIP (iiCLIP) para mejorar la eficiencia y la conveniencia de la preparación de bibliotecas de ADNc , por ejemplo, eliminando enzimáticamente el adaptador después de la ligación para minimizar los artefactos causados ​​por el arrastre del adaptador, introduciendo la visualización no radiactiva del complejo proteína-ARN (como se hizo originalmente con irCLIP ^{[ 8 ]} ), aumentando la eficiencia de las reacciones de ligación, proteinasa y transcripción inversa, y permitiendo la purificación de ADNc basada en perlas. ^{[ 14 ]}

El análisis de datos de secuenciación CLIP se beneficia del uso de software computacional personalizado, gran parte del cual está disponible como parte del pipeline Nextflow para el análisis CLIP , y hay software especializado disponible para la desmultiplexación rápida de bibliotecas multiplexadas complejas, ^{[ 15 ]} visualización comparativa de perfiles de entrecruzamiento a través de ARN, ^{[ 16 ]} identificación de los picos de sitios de entrecruzamiento proteína-ARN agrupados, e identificación de motivos de secuencia enriquecidos alrededor de entrecruzamientos prominentes. ^{[ 17 ]} Además, iMaps proporciona una plataforma web gratuita de análisis CLIP y una base de datos comunitaria bien curada para facilitar los estudios de redes reguladoras de ARN en diferentes organismos, con un backend basado en el pipeline Nextflow. Es aplicable a los muchos protocolos variantes de CLIP (como iCLIP, eCLIP, etc.), y se puede utilizar para analizar datos no publicados de manera segura, o para obtener datos CLIP públicos en un formato bien anotado, junto con varias formas de control de calidad, visualización y comparación. Las preguntas sobre los desafíos experimentales y computacionales se recopilan en el foro de preguntas y respuestas de CLIP .