Métodos de proteínas

Los métodos de proteínas son las técnicas que se utilizan para estudiar las proteínas . Existen métodos experimentales para estudiar las proteínas (por ejemplo, para detectar proteínas, para aislarlas y purificarlas, y para caracterizar la estructura y la función de las proteínas, ^[1] que a menudo requieren que la proteína se purifique primero). Los métodos computacionales suelen utilizar programas informáticos para analizar las proteínas. Sin embargo, muchos métodos experimentales (por ejemplo, la espectrometría de masas ) requieren un análisis computacional de los datos sin procesar. ^[2]

El análisis experimental de proteínas normalmente requiere la expresión y purificación de proteínas. La expresión se logra manipulando el ADN que codifica la(s) proteína(s) de interés. Por lo tanto, el análisis de proteínas generalmente requiere métodos de ADN, especialmente clonación . Algunos ejemplos de métodos genéticos incluyen la traducción conceptual, la mutagénesis dirigida al sitio , el uso de una proteína de fusión y la coincidencia de alelos con estados patológicos. ^[3] Algunas proteínas nunca se han secuenciado directamente, sin embargo, traduciendo codones de secuencias de ARNm conocidas en aminoácidos mediante un método conocido como traducción conceptual. (Ver código genético ). La mutagénesis dirigida al sitio introduce selectivamente mutaciones que cambian la estructura de una proteína. ^[4] La función de partes de las proteínas se puede entender mejor estudiando el cambio en el fenotipo como resultado de este cambio. Las proteínas de fusión se crean insertando etiquetas de proteína, como la etiqueta His , para producir una proteína modificada que es más fácil de rastrear. Un ejemplo de esto sería GFP-Snf2H que consiste en una proteína unida a una proteína fluorescente verde para formar una proteína híbrida. Al analizar el ADN, se pueden identificar alelos asociados a estados de enfermedad, como en el cálculo de puntuaciones LOD . ^[5]

La extracción de proteínas de tejidos con matrices extracelulares resistentes (por ejemplo, muestras de biopsia, tejidos venosos, cartílagos, piel) se logra a menudo en un entorno de laboratorio mediante pulverización por impacto en nitrógeno líquido. ^[6] Las muestras se congelan en nitrógeno líquido y posteriormente se someten a impacto o molienda mecánica. ^[7] Como el agua en las muestras se vuelve muy frágil a estas temperaturas, las muestras a menudo se reducen a una colección de fragmentos finos, que luego se pueden disolver para la extracción de proteínas. A veces se utilizan dispositivos de acero inoxidable conocidos como pulverizadores de tejidos para este propósito. Las ventajas de estos dispositivos incluyen altos niveles de extracción de proteínas a partir de muestras pequeñas y valiosas, las desventajas incluyen una contaminación cruzada de bajo nivel. ^[8]

La purificación de proteínas es un proceso crítico en biología molecular y bioquímica, cuyo objetivo es aislar una proteína específica de una mezcla compleja, como lisados ​​celulares o extractos de tejidos. ^[9] El objetivo es obtener la proteína en una forma pura que conserve su actividad biológica para estudios posteriores, incluidos ensayos funcionales, análisis estructurales o aplicaciones terapéuticas. El proceso de purificación generalmente implica varios pasos, incluida la lisis celular, la extracción de proteínas y una combinación de técnicas cromatográficas y electroforéticas. ^[10]

El aislamiento de proteínas se refiere a la extracción de proteínas de muestras biológicas, que pueden incluir tejidos, células u otros materiales. El proceso suele comenzar con la lisis celular, en la que se rompen las membranas celulares para liberar las proteínas en una solución. Esto se puede lograr mediante métodos físicos (por ejemplo, sonicación, homogeneización) o métodos químicos (por ejemplo, detergentes, enzimas). Después de la lisis, la mezcla suele clarificarse mediante centrifugación para eliminar los restos celulares y el material insoluble, lo que permite recolectar las proteínas solubles para una mayor purificación.

La cromatografía es una técnica ampliamente utilizada para la purificación de proteínas, que permite la separación de proteínas en función de diversas propiedades, como la carga, el tamaño y la afinidad de unión. Estos son los principales tipos de cromatografía que se utilizan en la purificación de proteínas:

La cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas en función de su carga neta a un pH determinado. La fase estacionaria consta de perlas de resina cargadas que interactúan con proteínas de carga opuesta. A medida que la muestra pasa por la columna, las proteínas se unen a la resina mientras que las proteínas no unidas se eliminan. Al cambiar gradualmente la fuerza iónica o el pH del tampón de elución, las proteínas unidas se pueden liberar de manera controlada, lo que permite una separación eficaz.

La cromatografía de exclusión por tamaño separa las proteínas en función de su tamaño. La fase estacionaria está compuesta por perlas porosas que permiten que las moléculas más pequeñas entren en los poros mientras que las moléculas más grandes pasan a través de ellas. Como resultado, las proteínas más grandes se eluyen primero, seguidas de las más pequeñas. Este método es particularmente útil para desalinizar o eliminar pequeños contaminantes de las muestras de proteínas.

La cromatografía de afinidad aprovecha las interacciones específicas entre las proteínas y sus ligandos. Una proteína objetivo se captura en una columna que contiene un ligando que se une específicamente a ella, como un anticuerpo, un sustrato enzimático o un ion metálico. Después de eliminar las proteínas unidas de forma no específica, la proteína objetivo se eluye utilizando una solución que interrumpe la interacción proteína-ligando. Este método proporciona una alta especificidad y se utiliza a menudo para purificar proteínas recombinantes que tienen etiquetas de afinidad.

La extracción de proteínas implica aislar proteínas de muestras biológicas complejas manteniendo su funcionalidad. A menudo requiere una elección cuidadosa de tampones de extracción que contengan sales, detergentes o estabilizadores para preservar la estructura y la actividad de las proteínas. El paso de solubilización es crucial para las proteínas que están unidas a la membrana o que son insolubles en soluciones acuosas. Se pueden utilizar detergentes como Triton X-100 o SDS para solubilizar las proteínas de las membranas alterando las bicapas lipídicas, lo que permite una extracción eficaz.

Después de la purificación inicial, puede ser necesario concentrar las soluciones de proteínas para aumentar la concentración de proteínas para aplicaciones posteriores. Esto se puede lograr mediante varios métodos, incluida la ultrafiltración, que utiliza membranas semipermeables para separar las proteínas de las moléculas más pequeñas y las sales, y la liofilización (secado por congelación), que elimina el agua y permite almacenar las proteínas en una forma estable. También se pueden emplear métodos de precipitación, como la precipitación con sulfato de amonio, para concentrar las proteínas modificando las condiciones de solubilidad.

La electroforesis en gel es una potente técnica analítica que se utiliza para separar proteínas en función de su tamaño y carga. Las proteínas se cargan en una matriz de gel, normalmente hecha de poliacrilamida o agarosa, y se aplica una corriente eléctrica. Las proteínas con carga negativa migran hacia el electrodo positivo; las proteínas más pequeñas se desplazan más rápido a través de la matriz de gel que las más grandes. Este método es fundamental para evaluar la pureza y el tamaño de las muestras de proteínas.

La electroforesis en gel desnaturalizante, que se realiza habitualmente mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio), implica el tratamiento de las proteínas con SDS, un detergente que las desnaturaliza y les confiere una carga negativa uniforme. Esto permite separar las proteínas únicamente en función de su peso molecular, lo que proporciona una imagen clara de la composición proteica de una muestra.

La electroforesis en gel no desnaturalizante permite que las proteínas mantengan su estructura nativa mientras se separan. Este método es útil para estudiar las interacciones proteína-proteína y las actividades enzimáticas. Las proteínas migran a través del gel en función de su tamaño y carga, pero sus propiedades funcionales permanecen intactas, lo que lo hace ideal para analizar complejos proteicos nativos.

La electroforesis en gel 2D combina el enfoque isoeléctrico (IEF) y la electroforesis en gel SDS-PAGE para lograr una separación de proteínas de alta resolución. En la primera dimensión, las proteínas se separan en función de sus puntos isoeléctricos (pI), mientras que en la segunda dimensión, se separan por peso molecular. Esta técnica permite el análisis de mezclas complejas de proteínas, facilitando la identificación de proteínas expresadas de forma diferencial en diversas condiciones.

El electroenfoque es una técnica especializada que separa las proteínas en función de sus puntos isoeléctricos en un gradiente de pH. A medida que se aplica un campo eléctrico, las proteínas migran hasta que alcanzan el punto en el que su carga neta es cero, concentrándose de manera efectiva en bandas estrechas. Este método proporciona una alta resolución y se utiliza a menudo en combinación con otras técnicas para realizar un análisis integral de las proteínas.

El tamaño considerablemente pequeño de las macromoléculas de proteínas hace que la identificación y cuantificación de muestras de proteínas desconocidas sea particularmente difícil. Se han desarrollado varios métodos confiables para cuantificar proteínas para simplificar el proceso. Estos métodos incluyen el método Warburg-Christian , el ensayo de Lowry y el ensayo de Bradford (todos los cuales se basan en las propiedades de absorbancia de las macromoléculas). El método de ensayo de Bradford utiliza un tinte para unirse a la proteína. El más común es el tinte azul brillante de Coomassie G-250. Cuando está libre de proteínas, el tinte es rojo, pero una vez unido a la proteína se vuelve azul. ^[11] El complejo tinte-proteína absorbe luz máximamente en la longitud de onda de 595 nanómetros y es sensible para muestras que contienen entre 1 ug y 60 ug. A diferencia de los métodos de Lowry y Warburg-Christian, los ensayos de Bradford no se basan en el contenido de triptófano y tirosina en las proteínas, lo que permite que el método sea hipotéticamente más preciso. El ensayo de Lowry es similar a los ensayos de biuret, pero utiliza el reactivo de Folin, que es más preciso para la cuantificación. El reactivo de Folin es estable solo en condiciones ácidas y el método es susceptible a sesgar los resultados dependiendo de la cantidad de triptófano y tirosina presente en la proteína examinada. ^[12] El reactivo de Folin se une al triptófano y la tirosina, lo que significa que la concentración de los dos aminoácidos afecta la sensibilidad del método. El método es sensible en rangos de concentración similares al método de Bradford, pero requiere una cantidad minúscula más de proteína. El método de Warburg-Christian examina las proteínas en sus rangos de absorbancia naturales. La mayoría de las proteínas absorben muy bien la luz a 280 nanómetros debido a la presencia de triptófano y tirosina, pero el método es susceptible a cantidades variables de los aminoácidos de los que depende.

A continuación se enumeran más métodos que contienen enlaces a explicaciones más detalladas de sus respectivos métodos.

• Absorbancia : se lee a 280 o 215 nm. Puede ser muy imprecisa. La detección se realiza en el rango de 100 μg/mL a 1 mg/mL. La relación de las lecturas de absorbancia tomadas a 260/280 puede indicar pureza/contaminación de la muestra (las muestras puras tienen una relación <0,8)
• Ensayo de proteína de Bradford : detección en el rango de ~1 mg/mL
• Ensayos derivados de la prueba de Biuret :
  • Ensayo de ácido bicinconínico (ensayo BCA) : detección hasta 0,5 μg/mL
  • Ensayo de proteína de Lowry : detección en el rango de 0,01 a 1,0 mg/ml
• Fluorescamina : cuantifica proteínas y péptidos en solución si hay aminas primarias presentes en los aminoácidos.
• Negro de amido : detección en el rango de 1-12 μg/mL
• Oro coloidal : detección en el rango de 20 - 640 ng/mL
• Detección de nitrógeno :
  • Método Kjeldahl : se utiliza principalmente para alimentos y requiere la oxidación del material.
  • Método Dumas : se utiliza principalmente para alimentos y requiere la combustión de material.

• Métodos de espectrometría :
  • Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) : método cromatográfico para detectar proteínas o péptidos.
  • Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC/MS) : puede detectar proteínas en concentraciones bajas (ng/mL a pg/mL) en sangre y fluidos corporales, como por ejemplo para farmacocinética .
• Métodos dependientes de anticuerpos :
  • Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ( ELISA ): puede detectar proteínas específicamente hasta pg/mL.
  • Inmunoprecipitación de proteínas : técnica de precipitación de un antígeno proteico de una solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína en particular.
  • Inmunoelectroforesis : separación y caracterización de proteínas basada en electroforesis y reacción con anticuerpos.
  • Western blot : combina electroforesis en gel e incubación con anticuerpos para detectar proteínas específicas en una muestra de homogeneizado o extracto de tejido (un tipo de técnica de inmunoelectroforesis ).
  • Inmunotinción de proteínas

• Cristalografía de rayos X
• RMN de proteínas
• Microscopía crioelectrónica
• Dispersión de rayos X de ángulo pequeño
• Dicroísmo circular

• Huella proteica

• Sistema de dos híbridos (levadura)
• Ensayo de complementación de fragmentos de proteínas
• Co-inmunoprecipitación
• Purificación por afinidad y espectrometría de masas
• Ensayo de ligadura por proximidad
• Etiquetado de proximidad

• Chip en chip
• Secuenciación de chips
• Identificación de presa
• Termoforesis a microescala

• Ensayo de impronta de dedos del pie
• secuencia TCP

• Dinámica molecular
• Predicción de la estructura de las proteínas
• Alineación de secuencias de proteínas (comparación de secuencias, incluido BLAST )
• Alineación estructural de proteínas
• Ontología de proteínas (ver ontología genética )

• Intercambio de hidrógeno y deuterio
• Espectrometría de masas
• Secuenciación de proteínas
• Síntesis de proteínas
• Proteómica
• Huella de masa de péptidos
• Ensayo de unión de ligando
• Transferencia oriental
• Etiquetado metabólico
  • Marcado de isótopos pesados
  • Marcado de isótopos radiactivos

• Protocolos CSH
• Protocolos actuales

• Daniel M. Bollag, Michael D. Rozycki y Stuart J. Edelstein. (1996.) Protein Methods , 2.ª edición, Wiley Publishers. ISBN  0-471-11837-0 .