Prueba de Biuret

En química , la prueba de Biuret (IPA: / ˌ b aɪ j ə ˈ r ɛ t / , / ˈ b aɪ j ə ˌ r ɛ t / ^{[ 1 ]} ), también conocida como prueba de Piotrowski , es una prueba química que se utiliza para detectar la presencia de al menos dos enlaces peptídicos en una molécula. En presencia de péptidos, un ion cobre (II) forma complejos de coordinación de color malva en una solución alcalina . La reacción se observó por primera vez en 1833. ^{[ 2 ]} En Polonia , la prueba de Biuret también se conoce como prueba de Piotrowski en honor al fisiólogo polaco Gustaw Piotrowski, quien la redescubrió de forma independiente en 1857. ^{[ 3 ]} Se han desarrollado varias variantes de la prueba, como la prueba BCA y la prueba de Lowry modificada. ^{[ 4 ]}

La reacción de Biuret se puede utilizar para evaluar la concentración de proteínas porque los enlaces peptídicos se producen con la misma frecuencia por aminoácido en el péptido. La intensidad del color, y por lo tanto la absorbancia a 540  nm, es directamente proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Beer-Lambert .

A pesar de su nombre, el reactivo no contiene biuret [ (H ₂ N−CO−) ₂ NH] . La prueba recibe ese nombre porque también da una reacción positiva a los enlaces peptídicos de la molécula de biuret.

En este ensayo, el cobre(II) se une a los átomos de nitrógeno presentes en los enlaces peptídicos de las proteínas. En una reacción secundaria, el cobre(II) se reduce a cobre(I). Los tampones, como el Tris y el amoníaco, interfieren con este ensayo, por lo que no es adecuado para muestras de proteínas purificadas mediante precipitación con sulfato de amonio. Debido a su baja sensibilidad y escasa interferencia de los aminoácidos libres, este ensayo resulta más útil para muestras de tejido completo y otras fuentes con alta concentración de proteínas. ^{[ 5 ]}

Una muestra acuosa se trata con un volumen igual de una base fuerte al 1% (hidróxido de sodio o potasio) seguido de unas gotas de sulfato de cobre(II) acuoso . Si la solución se torna púrpura, contiene proteína. Se pueden determinar concentraciones de 5 a 160  mg/ mL . Para obtener un cambio de color significativo y medible con estos reactivos, se requieren péptidos con la longitud correcta de al menos 3 aminoácidos. ^{[ 6 ]}

El reactivo de biuret se compone de hidróxido de sodio (NaOH) y sulfato de cobre(II) hidratado , junto con tartrato de potasio y sodio , ^{[ 7 ]} este último añadido para quelar y estabilizar los iones cúpricos. La reacción de los iones cúpricos con los átomos de nitrógeno involucrados en los enlaces peptídicos conduce al desplazamiento de los átomos de hidrógeno peptídicos en condiciones alcalinas. Una quelación tri- o tetradentada con el nitrógeno peptídico produce el color característico. Esto se observa en los dipéptidos. ^{[ 8 ]}

Este reactivo se utiliza habitualmente en el ensayo de proteínas de Biuret , una prueba colorimétrica que se emplea para determinar la concentración de proteínas mediante espectroscopia UV/VIS a una longitud de onda de 540 nm. 

En el análisis colorimétrico moderno de péptidos, se suelen aplicar dos modificaciones importantes de la prueba de Biuret: el ensayo de ácido bicinchonínico (BCA) y el ensayo de Lowry. En estas pruebas, el Cu ⁺ formado durante la reacción de Biuret reacciona posteriormente con otros reactivos, lo que produce un color más intenso.

En la prueba BCA , el Cu ⁺ forma un complejo de color púrpura intenso con el ácido bicinchonínico (BCA), ^{[ 9 ]} que absorbe alrededor de 562  nm, produciendo el característico color malva. El complejo BCA/cobre soluble en agua absorbe mucho más que el complejo péptido/cobre, lo que aumenta la sensibilidad de la prueba de biuret en un factor de aproximadamente 100: el ensayo BCA permite detectar proteínas en el rango de 0,0005 a 2  mg/mL. Además, el ensayo de proteínas BCA ofrece la importante ventaja de ser compatible con sustancias como hasta un 5 % de tensioactivos en muestras de proteínas.

En el ensayo de proteínas de Lowry , el Cu ⁺ se oxida de nuevo a Cu2 ⁺ por acción del Mo ^VI en el reactivo de Folin-Ciocalteu , que forma azul de molibdeno (Mo ^IV ). Los residuos de tirosina en la proteína también forman azul de molibdeno en estas circunstancias. De esta forma, las proteínas pueden detectarse en concentraciones entre 0,005 y 2  mg/mL. ^{[ 10 ]} El azul de molibdeno, a su vez, puede unirse a ciertos colorantes orgánicos como el verde malaquita y la auramina O , lo que produce una mayor amplificación de la señal. ^{[ 11 ]}

• Gold. 1990. Compuestos orgánicos en sistemas biológicos, 2ª ed. John Wiley & Sons, Inc.
• Reactivos químicos