Etiquetado de proximidad

El marcaje por proximidad catalizado por enzimas ( PL ), también conocido como marcaje basado en proximidad , es una técnica de laboratorio que marca biomoléculas , generalmente proteínas o ARN , próximas a una proteína de interés. ^{[ 1 ]} Al crear una fusión genética en una célula viva entre la proteína de interés y una enzima de marcaje modificada, las biomoléculas espacialmente próximas a la proteína de interés pueden marcarse selectivamente con biotina para su posterior análisis y purificación. El marcaje por proximidad se ha utilizado para identificar los componentes de nuevas estructuras celulares y para determinar los socios de interacción proteína-proteína , entre otras aplicaciones. ^{[ 2 ]}

Antes del desarrollo del marcaje por proximidad, la determinación de la proximidad de proteínas en las células se basaba en el estudio de las interacciones proteína-proteína mediante métodos como la purificación por afinidad-espectrometría de masas y los ensayos de ligación por proximidad . ^{[ 3 ]}

DamID es un método desarrollado en 2000 por Steven Henikoff para identificar partes del genoma próximas a una proteína de cromatina de interés. DamID se basa en la fusión de una ADN metiltransferasa a la proteína de cromatina para metilar el ADN de forma no natural, que luego puede secuenciarse para revelar los sitios de metilación del genoma cerca de la proteína. ^{[ 4 ]} Los investigadores se guiaron por la estrategia de proteína de fusión de DamID para crear un método para el marcaje sitio-específico de proteínas diana, culminando en la creación de BioID, basado en el marcaje de proteínas con biotina, en 2012. ^{[ 1 ]} Alice Ting y el laboratorio Ting en la Universidad de Stanford han diseñado varias proteínas que demuestran mejoras en la eficacia y velocidad del marcaje de proximidad basado en biotina. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]}

El marcaje por proximidad se basa en una enzima de marcaje capaz de biotinilar biomoléculas cercanas de forma indiscriminada. El marcaje con biotina se puede lograr mediante diversos métodos, según el tipo de enzima utilizada. BioID y TurboID emplean suplementación con biotina exógena; APEX y APEX2 utilizan biotina exógena, fenol y peróxido de hidrógeno.

• BioID, también conocida como BirA*, es una ligasa de biotina mutante de E. coli que cataliza la activación de la biotina por ATP. La biotina activada tiene una vida corta y, por lo tanto, solo puede difundirse a una región próxima a BioID. El marcaje se logra cuando la biotina activada reacciona con aminas cercanas , como las aminas de la cadena lateral de lisina que se encuentran en las proteínas. ^{[ 1 ]} TurboID es una ligasa de biotina diseñada mediante evolución dirigida por visualización en superficie de levadura . TurboID, una variante mejorada de BioID, permite tiempos de marcaje de ~10 minutos en lugar de los ~18 horas que requiere BioID. ^{[ 5 ]} Split-TurboID se puede utilizar para el marcaje por proximidad de una manera que depende de una interacción proteína-proteína independiente que requiere que las dos mitades de TurboID se colocalicen. ^{[ 9 ]}
• APEX es un derivado de la ascorbato peroxidasa que depende del peróxido de hidrógeno para catalizar la oxidación de la biotina-tiramida, también conocida como biotina-fenol, a un radical libre de biotina-fenol reactivo y de corta duración . El marcaje se logra cuando este intermediario reacciona con diversos grupos funcionales de biomoléculas cercanas. APEX también puede utilizarse para la deposición local de diaminobencidina, un precursor de un colorante para microscopía electrónica . APEX2 es un derivado de APEX diseñado mediante evolución dirigida por presentación en superficie de levadura. APEX2 muestra una mayor eficiencia de marcaje y niveles de expresión celular mejorados. ^{[ 8 ]}
• APEX y APEX2 generan intermediarios radicales fenoxilo altamente reactivos a partir de biotina-fenol permeable a la célula. Estos intermediarios interactúan principalmente con residuos de tirosina y triptófano en proteínas marcadas y guanosina en ARN marcados. ^{[ 10 ]} El marcaje directo de ADN es significativamente menos eficiente que el marcaje de ARN. BioID y TurboID crean intermediarios biotinilados-AMP a partir de ATP endógeno y biotina endógena o exógena para marcar residuos de lisina colocalizados o aminas primarias N-terminales en proteínas vecinas. ^{[ 11 ]} La biotinilación constitutiva de TurboID con biotina endógena y ATP puede ser citotóxica en algunos casos. ^{[ 5 ]}

Para marcar proteínas cercanas a una proteína de interés, un experimento típico de marcaje por proximidad comienza con la expresión celular de una proteína de fusión APEX2 a la proteína de interés, la cual se localiza en su entorno nativo. A continuación, las células se incuban con biotina-fenol y, posteriormente, brevemente con peróxido de hidrógeno, lo que inicia la generación de radicales libres de biotina-fenol y el marcaje. Para minimizar el daño celular, la reacción se detiene con un tampón antioxidante. Las células se lisan y las proteínas marcadas se precipitan con perlas de estreptavidina . Las proteínas se digieren con tripsina y, finalmente, los fragmentos peptídicos resultantes se analizan mediante métodos de proteómica de escopeta, ^como LC-MS/MS o SPS-MS ^{3. [ 8} ]

Si, por el contrario, una proteína de fusión no es genéticamente accesible (como en muestras de tejido humano), pero se conoce un anticuerpo para la proteína de interés, aún se puede realizar el marcaje por proximidad fusionando una enzima de marcaje con el anticuerpo y luego incubando la proteína de fusión con la muestra. ^{[ 12 ] [ 13 ]}

Los métodos de marcaje por proximidad se han utilizado para estudiar los proteomas de estructuras biológicas que de otro modo son difíciles de aislar de forma pura y completa, como los cilios , ^{[ 14 ]} las mitocondrias , ^{[ 6 ]} las hendiduras postsinápticas , ^{[ 2 ]} los cuerpos P , los gránulos de estrés , ^{[ 15 ]} y las gotas lipídicas . ^{[ 16 ]}

La fusión de APEX2 con receptores acoplados a proteínas G (GPCR) permite tanto el seguimiento de la señalización de GPCR con una resolución temporal de 20 segundos ^{[ 17 ]} como la identificación de proteínas desconocidas vinculadas a GPCR. ^{[ 18 ]}

El marcaje por proximidad también se ha utilizado para transcriptómica e interactómica . En 2019, Alice Ting y el laboratorio de Ting utilizaron APEX para identificar ARN localizado en compartimentos celulares específicos. ^{[ 19 ] [ 20 ]} En 2019, BioID se unió al transcrito de ARNm de beta-actina para estudiar su dinámica de localización. ^{[ 21 ]} El marcaje por proximidad también se ha utilizado para encontrar socios de interacción de fosfatasas de proteínas heterodiméricas, de la proteína Ago2 del miRISC (complejo de silenciamiento inducido por microARN) y de ribonucleoproteínas . ^{[ 3 ]}

El marcaje de proximidad basado en TurboID se ha utilizado para identificar reguladores de un receptor involucrado en la respuesta inmune innata , un receptor tipo NOD . ^{[ 22 ]} El marcaje de proximidad basado en BioID se ha utilizado para identificar la composición molecular de los invadopodios de células de cáncer de mama , que son importantes para la metástasis. ^{[ 23 ]} Los estudios de marcaje de proximidad basados ​​en biotina demuestran un mayor etiquetado de proteínas de regiones intrínsecamente desordenadas , lo que sugiere que el marcaje de proximidad basado en biotina puede utilizarse para estudiar las funciones de las IDR. ^{[ 24 ]} También se ha desarrollado una molécula pequeña fotosensibilizadora dirigida al núcleo para el marcaje de proximidad fotoactivable. ^{[ 25 ]}

Una nueva frontera en el campo del marcaje por proximidad explota la utilidad de la fotocatálisis para lograr una alta resolución espacial y temporal de los microambientes proteicos proximales. ^{[ 26 ]} Esta tecnología fotocatalítica aprovecha la energía fotónica de los fotocatalizadores a base de iridio para activar sondas de diazirina que pueden marcar proteínas proximales dentro de un radio reducido de aproximadamente cuatro nanómetros. ^{[ 27 ]} Esta tecnología fue desarrollada por el Centro de Ciencias Exploratorias de Merck en colaboración con investigadores de la Universidad de Princeton . ^{[ 27 ]} Esta tecnología se escindió del Centro de Ciencias Exploratorias de Merck en InduPro, una empresa de biotecnología fundada en 2022 por tres científicos de Merck, incluidos Rob Oslund y Niyi Fadeyi, quienes coinventaron la tecnología de mapeo. ^{[ 28 ]}