Alineación de secuencias

Ref.:  GTCGTAGAATA Lectura : CACGTAG—TA CIGAR: 2S5M2D2M donde: 2S = 2 recortes suaves (podrían ser desajustes o una lectura más larga que la secuencia coincidente) 5M = 5 coincidencias o desajustes 2D = 2 deleciones 2M = 2 coincidencias o desajustes

El formato CIGAR original del programa de alineación de exonerados no distinguía entre coincidencias o desajustes con el carácter M.

El documento de especificación SAMv1 define códigos CIGAR más recientes. En la mayoría de los casos, se prefiere usar los caracteres '=' y 'X' para indicar coincidencias o discrepancias, en lugar del antiguo carácter 'M', que resulta ambiguo.

• "Consumes query" y "consumes reference" indican si la operación CIGAR provoca que la alineación avance a lo largo de la secuencia de consulta y la secuencia de referencia, respectivamente.
• H solo puede estar presente como primera y/o última operación.
• S solo puede tener operaciones H entre ellos y los extremos de la cadena CIGAR.
• En el alineamiento de ARNm con el genoma, la operación N representa un intrón. Para otros tipos de alineamientos, la interpretación de N no está definida.
• La suma de las longitudes de las operaciones M/I/S/=/X será igual a la longitud de SEQ.

Una forma de cuantificar la utilidad de una alineación por pares dada es la " coincidencia única máxima " (MUM), o la subsecuencia más larga que aparece en ambas secuencias de consulta. Las secuencias MUM más largas suelen reflejar una relación más estrecha ^{[ 9 ]} en la alineación de secuencias múltiples de genomas en biología computacional . La identificación de MUM y otros anclajes potenciales es el primer paso en sistemas de alineación más grandes como MUMmer . Los anclajes son las áreas entre dos genomas donde son altamente similares. Para entender qué es una MUM, podemos desglosar cada palabra del acrónimo. Coincidencia implica que la subcadena aparece en ambas secuencias que se van a alinear. Único significa que la subcadena aparece solo una vez en cada secuencia. Finalmente, máximo indica que la subcadena no forma parte de otra cadena más larga que cumpla ambos requisitos anteriores. La idea detrás de esto es que las secuencias largas que coinciden exactamente y aparecen solo una vez en cada genoma son casi con certeza parte de la alineación global.

Más precisamente:

"Dados dos genomas A y B, la subcadena de coincidencia única máxima (MUM) es una subcadena común de A y B de longitud mayor que una longitud mínima especificada d (por defecto d= 20) tal que

• es máximo, es decir, no se puede extender en ninguno de los extremos sin incurrir en un desajuste; y
• es único en ambas secuencias" ^{[ 10 ]}

El método de matriz de puntos, que produce implícitamente una familia de alineamientos para regiones de secuencia individuales, es cualitativo y conceptualmente simple, aunque requiere mucho tiempo para analizar a gran escala. En ausencia de ruido, puede ser fácil identificar visualmente ciertas características de la secuencia, como inserciones, deleciones, repeticiones o repeticiones invertidas , a partir de un gráfico de matriz de puntos. Para construir un gráfico de matriz de puntos , las dos secuencias se escriben en la fila superior y la columna más a la izquierda de una matriz bidimensional y se coloca un punto en cualquier punto donde los caracteres de las columnas correspondientes coincidan; este es un gráfico de recurrencia típico . Algunas implementaciones varían el tamaño o la intensidad del punto según el grado de similitud de los dos caracteres, para acomodar sustituciones conservadoras. Los gráficos de puntos de secuencias muy relacionadas aparecerán como una sola línea a lo largo de la diagonal principal de la matriz .

Los problemas que presentan los diagramas de puntos como técnica de visualización de información incluyen: ruido, falta de claridad, poca intuición, dificultad para extraer estadísticas de resumen de coincidencias y posiciones de coincidencia en las dos secuencias. También se desperdicia mucho espacio, ya que los datos de coincidencia se duplican inherentemente en la diagonal y la mayor parte del área real del gráfico está ocupada por espacio vacío o ruido. Finalmente, los diagramas de puntos se limitan a dos secuencias. Ninguna de estas limitaciones se aplica a los diagramas de alineación de Miropeats, pero estos tienen sus propios defectos particulares.

Los diagramas de puntos también pueden utilizarse para evaluar la repetitividad en una secuencia. Una secuencia se puede representar gráficamente sobre sí misma, y ​​las regiones que comparten similitudes significativas aparecerán como líneas que se desvían de la diagonal principal. Este efecto se produce cuando una proteína consta de múltiples dominios estructurales similares .

La técnica de programación dinámica se puede aplicar para producir alineamientos globales mediante el algoritmo de Needleman-Wunsch y alineamientos locales mediante el algoritmo de Smith-Waterman . En el uso típico, los alineamientos de proteínas utilizan una matriz de sustitución para asignar puntuaciones a las coincidencias o desajustes de aminoácidos, y una penalización por hueco cuando un aminoácido de una secuencia coincide con un hueco en la otra. Los alineamientos de ADN y ARN pueden utilizar una matriz de puntuación, pero en la práctica a menudo simplemente asignan una puntuación de coincidencia positiva, una puntuación de desajuste negativa y una penalización por hueco negativa. (En la programación dinámica estándar, la puntuación de cada posición de aminoácido es independiente de la identidad de sus vecinos, por lo que no se tienen en cuenta los efectos de apilamiento de bases . Sin embargo, es posible tener en cuenta dichos efectos modificando el algoritmo). Una extensión común a los costos de hueco lineales estándar son los costos de hueco afines. Aquí se aplican dos penalizaciones de hueco diferentes para abrir un hueco y para extender un hueco. Normalmente, la primera es mucho mayor que la segunda, por ejemplo, -10 para la apertura del hueco y -2 para la extensión del hueco. Esto da como resultado menos huecos en una alineación y los residuos y los huecos se mantienen juntos, características más representativas de las secuencias biológicas. El algoritmo de Gotoh implementa costos de huecos afines mediante el uso de tres matrices. ^{[ 11 ] [ 12 ]}

La programación dinámica puede ser útil para alinear secuencias de nucleótidos con secuencias de proteínas, una tarea complicada por la necesidad de tener en cuenta las mutaciones de cambio de marco (generalmente inserciones o deleciones). El método framesearch produce una serie de alineamientos globales o locales por pares entre una secuencia de nucleótidos de consulta y un conjunto de secuencias de proteínas de búsqueda, o viceversa. Su capacidad para evaluar cambios de marco desplazados por un número arbitrario de nucleótidos hace que el método sea útil para secuencias que contienen un gran número de inserciones/deleciones, que pueden ser muy difíciles de alinear con métodos heurísticos más eficientes. En la práctica, el método requiere una gran cantidad de potencia de cálculo o un sistema cuya arquitectura esté especializada en programación dinámica. Los paquetes BLAST y EMBOSS proporcionan herramientas básicas para crear alineamientos traducidos (aunque algunos de estos enfoques aprovechan los efectos secundarios de las capacidades de búsqueda de secuencias de las herramientas). Hay métodos más generales disponibles en software de código abierto como GeneWise .

El método de programación dinámica garantiza encontrar una alineación óptima dada una función de puntuación específica; sin embargo, identificar una buena función de puntuación suele ser una cuestión empírica más que teórica. Si bien la programación dinámica se puede extender a más de dos secuencias, resulta excesivamente lenta para un gran número de secuencias o secuencias extremadamente largas.

Los métodos de palabras, también conocidos como métodos de k -tuplas, son métodos heurísticos que no garantizan encontrar una solución de alineación óptima, pero son significativamente más eficientes que la programación dinámica. Estos métodos son especialmente útiles en búsquedas en bases de datos a gran escala, donde se entiende que una gran proporción de las secuencias candidatas no tendrán prácticamente ninguna coincidencia significativa con la secuencia de consulta. Los métodos de palabras son más conocidos por su implementación en las herramientas de búsqueda de bases de datos FASTA y la familia BLAST . ^{[ 1 ]} Los métodos de palabras identifican una serie de subsecuencias cortas y no superpuestas ("palabras") en la secuencia de consulta que luego se comparan con secuencias candidatas de la base de datos. Las posiciones relativas de la palabra en las dos secuencias que se comparan se restan para obtener un desplazamiento; esto indicará una región de alineación si varias palabras distintas producen el mismo desplazamiento. Solo si se detecta esta región, estos métodos aplican criterios de alineación más sensibles; de esta manera, se eliminan muchas comparaciones innecesarias con secuencias sin similitud apreciable.

En el método FASTA, el usuario define un valor k que se utilizará como longitud de palabra para buscar en la base de datos. Este método es más lento, pero más sensible con valores bajos de k , que también se prefieren para búsquedas que involucran una secuencia de consulta muy corta. La familia de métodos de búsqueda BLAST proporciona varios algoritmos optimizados para tipos de consultas particulares, como la búsqueda de coincidencias de secuencias distantemente relacionadas. BLAST se desarrolló para proporcionar una alternativa más rápida a FASTA sin sacrificar mucha precisión; al igual que FASTA, BLAST utiliza una búsqueda de palabras de longitud k , pero evalúa solo las coincidencias de palabras más significativas, en lugar de todas las coincidencias de palabras como hace FASTA. La mayoría de las implementaciones de BLAST utilizan una longitud de palabra predeterminada fija que está optimizada para el tipo de consulta y base de datos, y que se cambia solo en circunstancias especiales, como cuando se busca con secuencias de consulta repetitivas o muy cortas. Se pueden encontrar implementaciones a través de varios portales web, como EMBL FASTA y NCBI BLAST .

La técnica de programación dinámica es teóricamente aplicable a cualquier número de secuencias; sin embargo, debido a su elevado coste computacional en tiempo y memoria , rara vez se utiliza para más de tres o cuatro secuencias en su forma más básica. Este método requiere la construcción del equivalente n -dimensional de la matriz de secuencias formada a partir de dos secuencias, donde n es el número de secuencias en la consulta. La programación dinámica estándar se aplica primero a todos los pares de secuencias de consulta y, a continuación, se rellena el "espacio de alineación" considerando posibles coincidencias o huecos en posiciones intermedias, construyendo finalmente una alineación esencialmente entre cada alineación de dos secuencias. Aunque esta técnica es computacionalmente costosa, su garantía de una solución óptima global resulta útil en casos donde solo se necesita alinear con precisión unas pocas secuencias. Un método para reducir las exigencias computacionales de la programación dinámica, que se basa en la función objetivo de "suma de pares" , se ha implementado en el paquete de software MSA . ^{[ 15 ]}

Los métodos progresivos, jerárquicos o de árbol generan un alineamiento múltiple de secuencias alineando primero las secuencias más similares y luego agregando secuencias o grupos sucesivamente menos relacionados al alineamiento hasta que todo el conjunto de consulta se haya incorporado a la solución. El árbol inicial que describe la relación entre las secuencias se basa en comparaciones por pares que pueden incluir métodos heurísticos de alineamiento por pares similares a FASTA . Los resultados del alineamiento progresivo dependen de la elección de las secuencias "más relacionadas" y, por lo tanto, pueden ser sensibles a las imprecisiones en los alineamientos por pares iniciales. La mayoría de los métodos progresivos de alineamiento múltiple de secuencias ponderan adicionalmente las secuencias en el conjunto de consulta según su relación, lo que reduce la probabilidad de realizar una mala elección de secuencias iniciales y, por lo tanto, mejora la precisión del alineamiento.

Se utilizan muchas variantes de la implementación progresiva de Clustal ^{[ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]} para el alineamiento de secuencias múltiples, la construcción de árboles filogenéticos y como entrada para la predicción de la estructura de proteínas . Una variante más lenta pero más precisa del método progresivo se conoce como T-Coffee . ^{[ 19 ]}

Los métodos iterativos intentan mejorar la fuerte dependencia de la precisión de los alineamientos iniciales por pares, que es el punto débil de los métodos progresivos. Los métodos iterativos optimizan una función objetivo basada en un método de puntuación de alineamiento seleccionado, asignando un alineamiento global inicial y luego realineando subconjuntos de secuencias. Estos subconjuntos realineados se alinean a su vez para producir el alineamiento múltiple de secuencias de la siguiente iteración. En ^{[ 20 ]} se revisan diversas formas de seleccionar los subgrupos de secuencias y la función objetivo.

La búsqueda de motivos, también conocida como análisis de perfiles, construye alineamientos múltiples de secuencias globales que intentan alinear motivos de secuencia cortos y conservados entre las secuencias del conjunto de consulta. Esto generalmente se realiza construyendo primero un alineamiento múltiple de secuencias global general, luego aislando las regiones altamente conservadas y usándolas para construir un conjunto de matrices de perfil. La matriz de perfil para cada región conservada está organizada como una matriz de puntuación, pero sus recuentos de frecuencia para cada aminoácido o nucleótido en cada posición se derivan de la distribución de caracteres de la región conservada en lugar de una distribución empírica más general. Luego, las matrices de perfil se usan para buscar ocurrencias del motivo que caracterizan en otras secuencias. En los casos en que el conjunto de datos original contenía un número pequeño de secuencias, o solo secuencias altamente relacionadas, se agregan pseudocuentas para normalizar las distribuciones de caracteres representadas en el motivo.

Una variedad de algoritmos de optimización general comúnmente utilizados en ciencias de la computación también se han aplicado al problema de alineación de secuencias múltiples. Los modelos ocultos de Markov se han utilizado para producir puntuaciones de probabilidad para una familia de posibles alineaciones de secuencias múltiples para un conjunto de consulta dado; aunque los primeros métodos basados ​​en HMM produjeron un rendimiento poco impresionante, aplicaciones posteriores han encontrado que son especialmente efectivos para detectar secuencias remotamente relacionadas porque son menos susceptibles al ruido creado por sustituciones conservadoras o semiconservadoras. ^{[ 21 ]} Los algoritmos genéticos y el recocido simulado también se han utilizado para optimizar las puntuaciones de alineación de secuencias múltiples según lo juzgado por una función de puntuación como el método de suma de pares. Se pueden encontrar detalles más completos y paquetes de software en el artículo principal alineación de secuencias múltiples .

La transformada de Burrows-Wheeler se ha aplicado con éxito a la alineación rápida de lecturas cortas en herramientas populares como Bowtie y BWA. Véase FM-index .

El método DALI, o alineación de matriz de distancias , es un método basado en fragmentos para construir alineaciones estructurales basadas en patrones de similitud de contacto entre hexapéptidos sucesivos en las secuencias de consulta. ^{[ 24 ]} Puede generar alineaciones por pares o múltiples e identificar los vecinos estructurales de una secuencia de consulta en el Protein Data Bank (PDB). Se ha utilizado para construir la base de datos de alineación estructural FSSP (Clasificación de pliegues basada en la alineación estructura-estructura de proteínas, o familias de proteínas estructuralmente similares). Se puede acceder a un servidor web DALI en DALI y la FSSP se encuentra en The Dali Database .

SSAP (programa de alineación de estructuras secuenciales) es un método de alineación estructural basado en programación dinámica que utiliza vectores átomo a átomo en el espacio estructural como puntos de comparación. Se ha ampliado desde su descripción original para incluir alineaciones múltiples y por pares, ^{[ 25 ]} y se ha utilizado en la construcción de la base de datos jerárquica CATH (Clase, Arquitectura, Topología, Homología) para la clasificación de plegamientos de proteínas. ^{[ 26 ]} Se puede acceder a la base de datos CATH en Clasificación de Estructuras de Proteínas CATH .

El método de extensión combinatoria de alineación estructural genera una alineación estructural por pares utilizando la geometría local para alinear fragmentos cortos de las dos proteínas que se analizan y luego ensambla estos fragmentos en una alineación más grande. ^{[ 27 ]} Basándose en medidas como la distancia cuadrática media de cuerpo rígido , las distancias entre residuos, la estructura secundaria local y las características del entorno circundante, como la hidrofobicidad de los residuos vecinos , se generan alineaciones locales llamadas "pares de fragmentos alineados" y se utilizan para construir una matriz de similitud que representa todas las posibles alineaciones estructurales dentro de criterios de corte predefinidos. Luego se traza una ruta desde un estado estructural de proteína al otro a través de la matriz extendiendo la alineación creciente un fragmento a la vez. La ruta óptima define la alineación de extensión combinatoria. Un servidor web que implementa el método y proporciona una base de datos de alineaciones por pares de estructuras en el Protein Data Bank se encuentra en el sitio web de Combinatorial Extension .

En bioinformática, los alineamientos de secuencias son útiles para identificar similitudes, generar árboles filogenéticos y desarrollar modelos de homología de estructuras proteicas. Sin embargo, su relevancia biológica no siempre es clara. A menudo se asume que los alineamientos reflejan cierto grado de cambio evolutivo entre secuencias descendientes de un ancestro común; no obstante, es posible que la evolución convergente produzca una similitud aparente entre proteínas evolutivamente no relacionadas, pero que desempeñan funciones similares y poseen estructuras parecidas.

En búsquedas en bases de datos como BLAST, los métodos estadísticos permiten determinar la probabilidad de que una alineación particular entre secuencias o regiones de secuencias surja por casualidad, considerando el tamaño y la composición de la base de datos consultada. Estos valores pueden variar significativamente según el espacio de búsqueda. En particular, la probabilidad de encontrar una alineación determinada por casualidad aumenta si la base de datos consta únicamente de secuencias del mismo organismo que la secuencia de consulta. Las secuencias repetitivas en la base de datos o en la consulta también pueden distorsionar tanto los resultados de la búsqueda como la evaluación de la significación estadística; BLAST filtra automáticamente dichas secuencias repetitivas en la consulta para evitar coincidencias aparentes que sean artefactos estadísticos.

En la literatura se encuentran disponibles métodos de estimación de significancia estadística para alineamientos de secuencias con huecos. ^{[ 28 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ]}

La significación estadística indica la probabilidad de que una alineación de una calidad determinada pueda surgir por casualidad, pero no indica cuán superior es una alineación dada con respecto a otras alineaciones de las mismas secuencias. Las medidas de credibilidad de la alineación indican el grado de similitud entre las alineaciones con mejor puntuación para un par de secuencias dado. En la literatura existen métodos para estimar la credibilidad de la alineación en el caso de alineaciones de secuencias con huecos. ^{[ 37 ]}

La elección de una función de puntuación que refleje observaciones biológicas o estadísticas sobre secuencias conocidas es fundamental para obtener alineamientos precisos. Las secuencias de proteínas se alinean frecuentemente mediante matrices de sustitución que reflejan las probabilidades de sustituciones de caracteres específicas. Una serie de matrices denominadas matrices PAM (matrices de mutación de punto aceptado, definidas originalmente por Margaret Dayhoff y a veces denominadas "matrices de Dayhoff") codifican explícitamente aproximaciones evolutivas sobre las tasas y probabilidades de mutaciones de aminoácidos particulares. Otra serie común de matrices de puntuación, conocida como BLOSUM (matriz de sustitución de bloques), codifica probabilidades de sustitución derivadas empíricamente. Se utilizan variantes de ambos tipos de matrices para detectar secuencias con distintos niveles de divergencia, lo que permite a los usuarios de BLAST o FASTA restringir las búsquedas a coincidencias más cercanas o ampliarlas para detectar secuencias más divergentes. Las penalizaciones por huecos tienen en cuenta la introducción de un hueco —en el modelo evolutivo, una mutación de inserción o deleción— tanto en secuencias de nucleótidos como de proteínas, por lo que los valores de penalización deben ser proporcionales a la tasa esperada de dichas mutaciones. Por lo tanto, la calidad de los alineamientos producidos depende de la calidad de la función de puntuación.

Puede resultar muy útil e instructivo probar la misma alineación varias veces con diferentes valores para la matriz de puntuación o la penalización por huecos, y comparar los resultados. A menudo, se pueden identificar las regiones donde la solución es débil o no única observando qué regiones de la alineación son robustas ante variaciones en los parámetros de alineación.