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Cribado de alto rendimiento

Robots de cribado de alto rendimiento El cribado de alto rendimiento ( HTS ) es un método de descubrimiento científico especialmente utilizado en el descubrimiento de fármacos y...

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Robots de cribado de alto rendimiento

El cribado de alto rendimiento ( HTS ) es un método de descubrimiento científico especialmente utilizado en el descubrimiento de fármacos y relevante para los campos de la biología , la ciencia de los materiales [ 1 ] y la química [ 2 ] [ 3 ] . Mediante robótica , software de procesamiento y control de datos, dispositivos de manipulación de líquidos y detectores sensibles, el cribado de alto rendimiento permite a un investigador realizar rápidamente millones de pruebas químicas, genéticas o farmacológicas. A través de este proceso, se pueden identificar rápidamente compuestos activos, anticuerpos o genes que modulan una vía biomolecular específica. Los resultados de estos experimentos proporcionan puntos de partida para el diseño de fármacos y para comprender la interacción o la función de una ubicación particular.

Preparación de placas de ensayo

Un brazo robótico manipula una placa de ensayo.

El material de laboratorio o recipiente de prueba clave para el cribado de alto rendimiento (HTS) es la placa de microtitulación , un pequeño recipiente, generalmente desechable y de plástico, que presenta una cuadrícula de pequeñas cavidades abiertas llamadas pocillos . En general, las microplacas para HTS tienen 96, 192, 384, 1536, 3456 o 6144 pocillos. Todos estos números son múltiplos de 96, lo que refleja la microplaca original de 96 pocillos con una separación de 8 x 12 y un  espaciado de 9 mm. La mayoría de los pocillos contienen elementos de prueba, según la naturaleza del experimento. Estos pueden ser diferentes compuestos químicos disueltos, por ejemplo, en una solución acuosa de dimetilsulfóxido (DMSO). Los pocillos también pueden contener células o enzimas de algún tipo. (Los demás pocillos pueden estar vacíos o contener disolvente puro o muestras sin tratar, destinadas a ser utilizadas como controles experimentales ).

Un laboratorio de cribado suele disponer de una biblioteca de placas de cultivo , cuyo contenido está cuidadosamente catalogado, y cada una de ellas puede haber sido creada por el propio laboratorio u obtenida de una fuente comercial. Estas placas de cultivo no se utilizan directamente en los experimentos; en su lugar, se crean placas de ensayo según sea necesario. Una placa de ensayo es simplemente una copia de una placa de cultivo, creada pipeteando una pequeña cantidad de líquido (a menudo medida en nanolitros ) desde los pocillos de una placa de cultivo a los pocillos correspondientes de una placa completamente vacía.

Observación de la reacción

Para preparar un ensayo , el investigador llena cada pocillo de la placa con alguna entidad biológica sobre la que desea realizar el experimento, como una proteína , células o un embrión animal . Tras un tiempo de incubación que permite que la materia biológica absorba, se una o reaccione (o no reaccione) con los compuestos de los pocillos, se toman mediciones en todos ellos, ya sea manualmente o mediante un sistema automatizado. Las mediciones manuales suelen ser necesarias cuando el investigador utiliza la microscopía para, por ejemplo, detectar cambios o defectos en el desarrollo embrionario causados ​​por los compuestos de los pocillos, buscando efectos que un ordenador no podría determinar fácilmente por sí solo. En otros casos, un sistema de análisis automatizado especializado puede realizar diversos experimentos en los pocillos (como iluminarlos con luz polarizada y medir la reflectividad, que puede indicar la unión de proteínas). En este caso, el sistema genera el resultado de cada experimento como una cuadrícula de valores numéricos, donde cada número corresponde al valor obtenido en un pocillo específico. Una máquina de análisis de alta capacidad puede medir docenas de placas en cuestión de minutos, generando miles de puntos de datos experimentales muy rápidamente.

En función de los resultados de este primer ensayo, el investigador puede realizar ensayos de seguimiento dentro de la misma pantalla seleccionando muestras de líquido de los pocillos de origen que dieron resultados interesantes (conocidos como "aciertos") para colocarlas en nuevas placas de ensayo y, a continuación, repetir el experimento para recopilar más datos sobre este conjunto reducido, confirmando y refinando las observaciones.

Sistemas de automatización

Un sistema de carrusel para almacenar placas de ensayo con alta capacidad de almacenamiento y acceso de alta velocidad.

La automatización es un elemento esencial en la utilidad del HTS. Normalmente, un sistema robótico integrado compuesto por uno o más robots transporta las microplacas de ensayo de una estación a otra para la adición de muestras y reactivos , la mezcla, la incubación y, finalmente, la lectura o detección. Un sistema HTS generalmente puede preparar, incubar y analizar muchas placas simultáneamente, lo que acelera aún más el proceso de recopilación de datos. Actualmente existen robots HTS que pueden analizar hasta 100 000 compuestos por día. [ 4 ] [ 5 ] Los recolectores automáticos de colonias recogen miles de colonias microbianas para el cribado genético de alto rendimiento. [ 6 ] El término uHTS o cribado de ultra alto rendimiento se refiere (alrededor de 2008) al cribado de más de 100 000 compuestos por día. [ 7 ]

Diseño experimental y análisis de datos

Con la capacidad de realizar un cribado rápido de diversos compuestos (como moléculas pequeñas o siRNAs ) para identificar compuestos activos, el HTS ha dado lugar a una explosión en la tasa de datos generados en los últimos años. [ 8 ] En consecuencia, uno de los desafíos más fundamentales en los experimentos de HTS es extraer significado bioquímico de montones de datos, lo que depende del desarrollo y la adopción de diseños experimentales y métodos analíticos apropiados tanto para el control de calidad como para la selección de resultados positivos. [ 9 ] La investigación en HTS es uno de los campos que tiene una característica descrita por John Blume, director científico de Applied Proteomics, Inc., de la siguiente manera: Pronto, si un científico no entiende algunas estadísticas o tecnologías rudimentarias de manejo de datos, puede que no se le considere un verdadero biólogo molecular y, por lo tanto, simplemente se convertirá en "un dinosaurio". [ 10 ]

Control de calidad

Los ensayos HTS de alta calidad son fundamentales en los experimentos HTS. El desarrollo de ensayos HTS de alta calidad requiere la integración de enfoques tanto experimentales como computacionales para el control de calidad (CC). Tres medios importantes de CC son: (i) un buen diseño de la placa, (ii) la selección de controles químicos/biológicos positivos y negativos eficaces, y (iii) el desarrollo de métricas de CC eficaces para medir el grado de diferenciación, de modo que se puedan identificar los ensayos con datos de calidad inferior. [ 11 ] Un buen diseño de la placa ayuda a identificar errores sistemáticos (especialmente aquellos relacionados con la posición del pozo) y a determinar qué normalización debe utilizarse para eliminar/reducir el impacto de los errores sistemáticos tanto en el CC como en la selección de resultados positivos. [ 9 ]

Los métodos de control de calidad analíticos eficaces sirven como garante de ensayos de excelente calidad. En un experimento HTS típico, una clara distinción entre un control positivo y una referencia negativa, como un control negativo, es un indicador de buena calidad. Se han propuesto muchas medidas de evaluación de la calidad para medir el grado de diferenciación entre un control positivo y una referencia negativa. La relación señal-fondo, la relación señal-ruido, la ventana de señal, la relación de variabilidad del ensayo y el factor Z se han adoptado para evaluar la calidad de los datos. [ 9 ] [ 12 ] Recientemente se ha propuesto la diferencia de medias estrictamente estandarizada ( SSMD ) para evaluar la calidad de los datos en ensayos HTS. [ 13 ] [ 14 ]

Selección de golpes

Un compuesto con un tamaño de efecto deseado en un HTS se denomina "hit". El proceso de selección de hits se denomina selección de hits. Los métodos analíticos para la selección de hits en cribados sin réplicas (generalmente en cribados primarios) difieren de los utilizados con réplicas (generalmente en cribados confirmatorios). Por ejemplo, el método de puntuación z es adecuado para cribados sin réplicas, mientras que el estadístico t es adecuado para cribados con réplicas. El cálculo de SSMD para cribados sin réplicas también difiere del utilizado para cribados con réplicas. [ 9 ]

Para la selección de compuestos activos en ensayos primarios sin réplicas, los parámetros más fáciles de interpretar son el cambio de expresión promedio, la diferencia media, el porcentaje de inhibición y el porcentaje de actividad. Sin embargo, no capturan la variabilidad de los datos de manera efectiva. El método de puntuación z o SSMD puede capturar la variabilidad de los datos basándose en la suposición de que cada compuesto tiene la misma variabilidad que una referencia negativa en los ensayos. [ 15 ] [ 16 ] Sin embargo, los valores atípicos son comunes en los experimentos HTS, y métodos como la puntuación z son sensibles a los valores atípicos y pueden ser problemáticos. En consecuencia, se han propuesto y adoptado métodos robustos como el método de puntuación z*, SSMD*, el método de puntuación B y el método basado en cuantiles para la selección de compuestos activos. [ 5 ] [ 9 ] [ 17 ] [ 18 ]

En una pantalla con réplicas, podemos estimar directamente la variabilidad para cada compuesto; en consecuencia, deberíamos usar SSMD o el estadístico t que no se basa en el fuerte supuesto en el que se basan la puntuación z y la puntuación z*. Un problema con el uso del estadístico t y los valores p asociados es que se ven afectados tanto por el tamaño de la muestra como por el tamaño del efecto. [ 19 ] Provienen de pruebas de no diferencia de medias y, por lo tanto, no están diseñados para medir el tamaño de los efectos de los compuestos. Para la selección de resultados positivos, el principal interés es el tamaño del efecto en un compuesto probado. SSMD evalúa directamente el tamaño de los efectos. [ 20 ] También se ha demostrado que SSMD es mejor que otros tamaños de efecto comúnmente utilizados. [ 21 ] El valor poblacional de SSMD es comparable entre experimentos y, por lo tanto, podemos usar el mismo umbral para el valor poblacional de SSMD para medir el tamaño de los efectos de los compuestos. [ 22 ]

Técnicas para aumentar el rendimiento y la eficiencia.

Se pueden emplear distribuciones únicas de compuestos en una o varias placas para aumentar el número de ensayos por placa, reducir la varianza de los resultados o ambas cosas. La simplificación que se hace en este enfoque se basa en la suposición de que cualquier conjunto de N compuestos en un mismo pocillo no interactuará entre sí, ni con el objetivo del ensayo, de una manera que altere fundamentalmente la capacidad del ensayo para detectar resultados positivos.

Por ejemplo, imaginemos una placa donde el compuesto A se encuentra en los pocillos 1, 2 y 3, el compuesto B en los pocillos 2, 3 y 4, y el compuesto C en los pocillos 3, 4 y 5. En un ensayo de esta placa contra un objetivo determinado, un resultado positivo en los pocillos 2, 3 y 4 indicaría que el compuesto B es el agente más probable, a la vez que proporcionaría tres mediciones de su eficacia contra el objetivo especificado. Las aplicaciones comerciales de este método implican combinaciones en las que ningún par de compuestos comparte más de un pocillo, para reducir la posibilidad (de segundo orden) de interferencia entre pares de compuestos que se están analizando.

avances recientes

Los científicos del Centro de Genómica Química de los NIH (NCGC) aprovecharon la automatización y los formatos de ensayo de bajo volumen para desarrollar el HTS cuantitativo (qHTS), un paradigma para perfilar farmacológicamente grandes bibliotecas químicas mediante la generación de relaciones completas de concentración-respuesta para cada compuesto. Con el software de ajuste de curvas y quimioinformática que lo acompaña, los datos de qHTS proporcionan la concentración efectiva media máxima (EC50), la respuesta máxima y el coeficiente de Hill (nH) para toda la biblioteca, lo que permite evaluar las relaciones estructura-actividad (SAR) nacientes. [ 23 ]

En marzo de 2010, se publicó una investigación que demostraba un proceso HTS que permitía un cribado 1000 veces más rápido (100 millones de reacciones en 10 horas) a un coste 1 millonésima parte (utilizando 10⁻⁷ veces el volumen de reactivo) que las técnicas convencionales que utilizan microfluídica basada en gotas . [ 23 ] Las gotas de fluido separadas por aceite reemplazan los pocillos de las microplacas y permiten el análisis y la clasificación de resultados mientras los reactivos fluyen a través de los canales.

En 2010, los investigadores desarrollaron una lámina de silicio con lentes que se puede colocar sobre matrices microfluídicas para permitir la medición de fluorescencia de 64 canales de salida diferentes simultáneamente con una sola cámara. [ 24 ] Este proceso puede analizar 200 000 gotas por segundo.

En 2013, investigadores revelaron un enfoque con moléculas pequeñas de plantas. En general, es esencial proporcionar validaciones de prueba de concepto de alta calidad al inicio del proceso de descubrimiento de fármacos. En este sentido, las tecnologías que permiten la identificación de sondas químicas potentes, selectivas y biodisponibles son de vital importancia, incluso si los compuestos resultantes requieren una optimización adicional para su desarrollo como producto farmacéutico. El receptor nuclear RORα, una proteína que ha sido objeto de estudio durante más de una década para identificar agonistas potentes y biodisponibles, se utilizó como ejemplo de una diana farmacológica muy compleja. Los resultados positivos se confirman en la etapa de cribado debido a la curva en forma de campana. Este método es muy similar al método HTS cuantitativo (cribado y confirmación de resultados positivos simultáneamente), con la diferencia de que este enfoque reduce considerablemente el número de puntos de datos y permite analizar fácilmente más de 100 000 compuestos biológicamente relevantes. [ 25 ]

Al pasar de un agitador orbital, que requería tiempos de molienda de 24 horas y al menos 10 mg de compuesto farmacéutico, a un mezclador acústico resonante, Merck informó una reducción del tiempo de procesamiento a menos de 2 horas con solo 1-2 mg de compuesto farmacéutico por pocillo. Merck también indicó que el método de molienda acústica permite la preparación de formulaciones de nanosuspensión de alta dosis que no se podían obtener con equipos de molienda convencionales. [ 26 ]

Mientras que el descubrimiento de fármacos mediante HTS tradicional utiliza proteínas purificadas o células intactas, el desarrollo reciente de la tecnología se asocia con el uso de organismos vivos intactos, como el nematodo Caenorhabditis elegans y el pez cebra ( Danio rerio ). [ 27 ]

Entre 2016 y 2018, los fabricantes de placas comenzaron a producir productos químicos especializados para permitir la producción en masa de superficies repelentes de células con adherencia ultrabaja, lo que facilitó el rápido desarrollo de ensayos aptos para HTS para abordar el descubrimiento de fármacos contra el cáncer en tejidos 3D como organoides y esferoides; un formato más relevante desde el punto de vista fisiológico. [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ]

Mayor uso de HTS en el ámbito académico para la investigación biomédica.

La detección de alto rendimiento (HTS) es una innovación relativamente reciente, posible en gran medida gracias a los avances modernos en robótica y tecnología informática de alta velocidad. Aún se requiere un laboratorio de cribado altamente especializado y costoso para llevar a cabo una operación de HTS, por lo que, en muchos casos, una institución de investigación de tamaño pequeño a mediano utilizará los servicios de una instalación de HTS ya existente en lugar de establecer una propia.

Existe una tendencia en el ámbito académico a que las universidades se conviertan en sus propias empresas de descubrimiento de fármacos. [ 31 ] Estas instalaciones, que normalmente solo se encuentran en la industria, ahora también se encuentran cada vez más en las universidades. UCLA , por ejemplo, cuenta con un laboratorio HTS de acceso abierto, Molecular Screening Shared Resources (MSSR, UCLA), que puede analizar más de 100 000 compuestos al día de forma rutinaria. La política de acceso abierto garantiza que investigadores de todo el mundo puedan aprovechar estas instalaciones sin largas negociaciones de propiedad intelectual. Con una biblioteca de compuestos de más de 200 000 moléculas pequeñas, el MSSR tiene uno de los mayores conjuntos de compuestos de todas las universidades de la costa oeste. Además, el MSSR cuenta con capacidades completas de genómica funcional (siRNA, shRNA, cDNA y CRISPR a nivel genómico) que son complementarias a los esfuerzos en moléculas pequeñas: la genómica funcional aprovecha las capacidades HTS para ejecutar análisis a nivel genómico que examinan la función de cada gen en el contexto de interés, ya sea inactivando cada gen o sobreexpresándolo. El acceso simultáneo a la detección de moléculas pequeñas de alto rendimiento y a la detección de todo el genoma permite a los investigadores identificar y validar dianas para una enfermedad específica o determinar el mecanismo de acción de una molécula pequeña. Los resultados más precisos se obtienen mediante el uso de bibliotecas de genómica funcional en formato de matriz, donde cada biblioteca contiene una única construcción, como un ARNip o un ADNc. La genómica funcional se suele combinar con la detección de alto contenido mediante técnicas como la microscopía de epifluorescencia o la citometría de barrido láser.

La Universidad de Illinois también cuenta con instalaciones para HTS, al igual que la Universidad de Minnesota. El Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Michigan alberga las instalaciones de HTS en el Centro de Genómica Química. La Universidad de Columbia dispone de un centro de recursos compartidos de HTS con aproximadamente 300 000 moléculas pequeñas diversas y unos 10 000 compuestos bioactivos conocidos disponibles para cribado bioquímico, celular y basado en NGS. La Universidad Rockefeller cuenta con un Centro de Recursos de HTS de acceso abierto , HTSRC (The Rockefeller University, HTSRC ), que ofrece una biblioteca de más de 380 000 compuestos. El Laboratorio de Análisis de Alto Rendimiento de la Universidad Northwestern apoya la identificación de objetivos, la validación, el desarrollo de ensayos y el cribado de compuestos. El Instituto Sanford Burnham Prebys de Descubrimiento Médico, una organización sin ánimo de lucro, también dispone de instalaciones de HTS de larga trayectoria en el Centro Conrad Prebys de Genómica Química, que formaba parte del MLPCN. El Centro de Cribado Molecular de Investigación Scripps (SRMSC) , una organización sin fines de lucro [ 32 ], continúa prestando servicios a la comunidad académica en diversos institutos tras la era de MLPCN. Las instalaciones de uHTS del SRMSC mantienen una de las mayores colecciones de bibliotecas en el ámbito académico, que actualmente supera las 665 000 entidades de moléculas pequeñas, y realizan análisis rutinarios de la colección completa o de subbibliotecas en apoyo de iniciativas de subvenciones con múltiples investigadores principales.

En Estados Unidos, los Institutos Nacionales de Salud (NIH) han creado un consorcio nacional de centros de cribado de moléculas pequeñas para producir herramientas químicas innovadoras para su uso en la investigación biológica. La Red de Centros de Producción de Sondas de Bibliotecas Moleculares (MLPCN) realiza cribado de alto rendimiento (HTS) en ensayos proporcionados por la comunidad científica, frente a una amplia biblioteca de moléculas pequeñas mantenida en un repositorio central de moléculas. Además, los NIH crearon el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS), ubicado en Shady Grove, Maryland, que lleva a cabo cribados de moléculas pequeñas y de ARN de interferencia (ARNi ) en colaboración con laboratorios académicos. Cabe destacar que el cribado de moléculas pequeñas utiliza placas de 1536 pocillos, una capacidad poco común en laboratorios de cribado académicos que permite realizar HTS cuantitativo, en el que cada compuesto se prueba en un rango de concentraciones de cuatro a cinco órdenes de magnitud. [ 23 ]

Véase también

Referencias

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  28. ↑ Kota, S.; Hou, S.; Guerrant, W.; Madoux, F.; Troutman, S.; Fernandez-Vega, V.; Alekseeva, N.; Madala, N.; Scampavia, L.; Kissil, J.; Spicer, TP. (10 de mayo de 2018). " Un nuevo enfoque de cribado tridimensional de alto rendimiento identifica inductores de un fenotipo letal selectivo de KRAS mutante" . Oncogene . 37 (32): 4372– 4384. doi : 10.1038/s41388-018-0257-5 . PMC 6138545. PMID 29743592 .  
  29. ↑ Hou, S.; Tiriac, H.; Sridharan, BP.; Scampavia, L.; Madoux, F.; Seldin, J.; Souza, GR.; Watson, D.; Tuveson, D.; Spicer, TP. (julio de 2018). "Desarrollo avanzado de modelos tumorales organoides pancreáticos primarios para la detección fenotípica de fármacos de alto rendimiento" . SLAS Discovery . 23 (6): 574– 584. doi : 10.1177/2472555218766842 . PMC 6013403. PMID 29673279 .  
  30. ↑ Madoux, F.; Tanner, A.; Vessels, M.; Willetts, L.; Hou, S.; Scampavia, L.; Spicer, TP. (junio de 2017). "Un ensayo de viabilidad 3D de 1536 pocillos para evaluar el efecto citotóxico de fármacos en esferoides" . SLAS Discovery . 22 (5): 516– 524. doi : 10.1177/2472555216686308 . PMID 28346088 . 
  31. ↑ Dove, Alan (2007). "El cribado de alto rendimiento va a la escuela" . Nature Methods . 4 (6): 523– 532. doi : 10.1038/nmeth0607-523 . ISSN 1548-7091 . S2CID 28059031 .  
  32. ↑ Baillargeon P, Fernandez-Vega V, Sridharan BP, Brown S, Griffin PR, Rosen H, et al. (2019). " The Scripps Molecular Screening Center and Translational Research Institute" . SLAS Discov . 24 (3): 386– 397. doi : 10.1177/2472555218820809 . PMC 7724958. PMID 30682260. S2CID 59274228 .    

Lecturas adicionales

  • Lin, Yibin (2018). "¿Qué ha sucedido en los últimos cinco años con el cribado de cristalización de proteínas de alto rendimiento?" . Expert Opinion on Drug Discovery . 13 (8): 691– 695. doi : 10.1080/17460441.2018.1465924 . ISSN 1746-0441 . PMID 29676184 .  
  • Personal (1 de agosto de 2008). "Desafíos del cribado de alto rendimiento" . Genetic Engineering & Biotechnology News . Mesa redonda sobre descubrimiento de fármacos. Vol.  28, n.º  14. Mary Ann Liebert. págs. 26-27 . ISSN 1935-472X . Consultado el 1 de octubre de 2008 .  
  • Zhang XHD (2011) "Cribado óptimo de alto rendimiento: diseño experimental práctico y análisis de datos para la investigación de ARN interferente a escala genómica, Cambridge University Press"
  • Florian, Amy; Lepensky, C; Kwon, O; Sklar, L; Haynes, M (201). "La citometría de flujo permite un ensayo de unión de anticuerpos fluorescentes homogéneo de alto rendimiento para la exocitosis de gránulos líticos de células T citotóxicas" . Journal of Biomolecular Screening . 4 (18): 420– 429. doi : 10.1177/1087057112466697 . PMC 4043149. PMID 23160568 .  La citometría de flujo permite un ensayo de unión de anticuerpos fluorescentes homogéneo de alto rendimiento para la exocitosis de gránulos líticos de células T citotóxicas.
  • Florian, Amy E.; Lepensky, Christopher K.; Kwon, Ohyun; Haynes, Mark K.; Sklar, Larry A.; Zweifach, Adam (2013). "La citometría de flujo permite un ensayo de unión de anticuerpos fluorescentes homogéneo de alto rendimiento para la exocitosis de gránulos líticos de células T citotóxicas" . Journal of Biomolecular Screening . 18 (4): 420– 429. doi : 10.1177/1087057112466697 . ISSN 1087-0571 . PMC 4043149. PMID 23160568 .   
  • Entorno de proyección abierto
  • Montaje de un laboratorio de cribado de alto rendimiento (Koppal, revista Lab Manager)
  • Manual de orientación para ensayos (NIH, NCGC)