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Articulo de referencia

matriz genética sintética

El análisis de matrices genéticas sintéticas ( SGA ) es una técnica de alto rendimiento para explorar interacciones genéticas letales sintéticas y de enfermedad sintética ( SSL ...

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El análisis de matrices genéticas sintéticas ( SGA ) es una técnica de alto rendimiento para explorar interacciones genéticas letales sintéticas y de enfermedad sintética ( SSL ). [ 1 ] SGA permite la construcción sistemática de mutantes dobles utilizando una combinación de técnicas genéticas recombinantes , apareamiento y pasos de selección. Utilizando la metodología SGA, un mutante de deleción de un gen de consulta puede cruzarse con un conjunto de deleciones de todo el genoma para identificar cualquier interacción SSL , lo que produce información funcional del gen de consulta y los genes con los que interactúa. Una aplicación a gran escala de SGA en la que ~130 genes de consulta se cruzaron con el conjunto de ~5000 mutantes de deleción viables en levadura reveló una red genética que contiene ~1000 genes y ~4000 interacciones SSL. [ 2 ] Los resultados de este estudio mostraron que los genes con funciones similares tienden a interactuar entre sí y los genes con patrones similares de interacciones genéticas a menudo codifican productos que tienden a funcionar en la misma vía o complejo. El análisis de matrices genéticas sintéticas se desarrolló inicialmente utilizando el organismo modelo S. cerevisiae . Este método se ha extendido posteriormente para cubrir el 30% del genoma de S. cerevisiae . [ 3 ] Posteriormente se ha desarrollado una metodología que permite el análisis de SGA en S. pombe [ 4 ] [ 5 ] y E. coli . [ 6 ] [ 7 ]

Levaduras dispuestas en matrices que muestran interacciones letales sintéticas. Las interacciones letales sintéticas son aquellos pares de colonias con crecimiento reducido o nulo.

Fondo

El análisis de matrices genéticas sintéticas fue desarrollado inicialmente por Tong et al. [ 1 ] en 2001 y desde entonces ha sido utilizado por muchos grupos que trabajan en una amplia gama de campos biomédicos. SGA utiliza el conjunto completo de mutantes de levadura con eliminación de genes creado por el proyecto de eliminación del genoma de la levadura. [ 8 ]

Procedimiento

El análisis de matrices genéticas sintéticas generalmente se lleva a cabo utilizando matrices de colonias en placas de Petri a densidades estándar (96, 384, 768, 1536). Para realizar un análisis SGA en S. cerevisiae , la deleción del gen de consulta se cruza sistemáticamente con una matriz de mutantes de deleción (DMA) que contiene cada ORF knockout viable del genoma de la levadura (actualmente 4786 cepas). [ 9 ] Los diploides resultantes luego se esporulan transfiriéndolos a un medio que contiene nitrógeno reducido. La progenie haploide luego pasa por una serie de placas de selección e incubaciones para seleccionar mutantes dobles. Los mutantes dobles se examinan para interacciones SSL visualmente o utilizando software de imágenes evaluando el tamaño de las colonias resultantes.

Replicación de colonias de levadura durante el análisis SGA utilizando el robot de fijación ROTOR+ High Density Arraying (Singer Instruments).

Robótica

Debido a la gran cantidad de pasos de replicación precisos en el análisis SGA, los robots se utilizan ampliamente para realizar la manipulación de colonias. Existen algunos sistemas diseñados específicamente para el análisis SGA, que reducen considerablemente el tiempo de análisis de un gen de interés. Generalmente, estos sistemas cuentan con una serie de pines que se utilizan para transferir células hacia y desde las placas, y un sistema utiliza almohadillas desechables de pines para eliminar los ciclos de lavado. Se pueden usar programas informáticos para analizar el tamaño de las colonias a partir de imágenes de las placas, automatizando así la puntuación SGA y el perfilado químico-genético.

Pasos para un sistema de cribado genético de alto rendimiento en todo el genoma de levadura (hoja de ruta SGA)

Hay seis componentes principales:

  1. Colección de mutantes
  2. Materiales y herramientas para el manejo de los mutantes
  3. Sistema de análisis de imágenes
  4. Sistema automático de cuantificación y puntuación
  5. Enfoques de confirmación
  6. Herramientas de análisis de datos

Véase también

Referencias

  1. 1 2 Tong, AHY; Evangelista, M.; Parsons, AB; Xu, H.; Bader, GD; Pagé, N.; Robinson, M.; Raghibizadeh, S.; Hogue, CW; Bussey, H.; Andrews, B.; Tyers, M.; Boone, C. (2001). "Análisis genético sistemático con matrices ordenadas de mutantes de deleción de levadura". Science . 294 (5550): 2364– 2368. Bibcode : 2001Sci...294.2364T . doi : 10.1126/science.1065810 . PMID 11743205 . S2CID 6505287 .  
  2. ↑ Tong, AHY; Lesage, G.; Bader, GD; Ding, H.; Xu, H.; Xin, X.; Young, J.; Berriz, GF; Brost, RL; Chang, M.; Chen, Y.; Cheng, X.; Chua, G.; Friesen, H.; Goldberg, DS; Haynes, J.; Humphries, C.; He, G.; Hussein, S.; Ke, L.; Krogan, N.; Li, Z.; Levinson, JN; Lu, H.; Ménard, P.; Munyana, C.; Parsons, AB; Ryan, O.; Tonikian, R.; Roberts, T. (2004). "Mapeo global de la red de interacción genética de la levadura". Science . 303 (5659): 808– 813. Bibcode : 2004Sci...303..808T . doi : 10.1126/ science.1091317 . PMID 14764870. S2CID 11465508 .  
  3. ^ Costanzo, M.; Baryshnikova, A.; Bellay, J.; Kim, Y.; Lanza, ED; Sevier, CS; Ding, H.; Koh, JLY; Toufighi, K.; Mostafavi, S.; Prinz, J.; San Onge, RP; Vandersluis, B.; Makhnevych, T.; Vizeacumar, FJ; Alizadeh, S.; Bahr, S.; Brost, RL; Chen, Y.; Cokol, M.; Deshpande, R.; Li, Z.; Lin, Z.-Y.; Liang, W.; Marback, M.; Pata, J.; San Luis, B.-J.; Shuteriqi, E.; Tong, AHY; Van Dyk, N. (2010). "El paisaje genético de una célula" . Ciencia . 327 (5964): 425– 431. Bibcode : 2010Sci...327..425C . doi : 10.1126/science.1180823 . PMC 5600254 . PMID 20093466 .  
  4. ↑ Roguev, A.; Wiren, M.; Weissman, JS; Krogan, NJ (2007). "Mapeo de interacciones genéticas de alto rendimiento en la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe". Nature Methods . 4 (10): 861– 866. doi : 10.1038/nmeth1098 . PMID 17893680 . S2CID 21870145 .  
  5. ↑ Dixon, SJ; Fedyshyn, Y.; Koh, JLY; Prasad, TSK; Chahwan, C.; Chua, G.; Toufighi, K.; Baryshnikova, A.; Hayles, J.; Hoe, K. -L.; Kim, D. -U.; Park, H. -O.; Myers, CL; Pandey, A.; Durocher, D.; Andrews, BJ; Boone, C. (2008). "Conservación significativa de redes de interacción genética letal sintética entre eucariotas distantemente relacionados" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 105 (43): 16653– 16658. Bibcode : 2008PNAS..10516653D . doi : 10.1073/pnas.0806261105 . PMC 2575475 . PMID 18931302 .  
  6. ↑Typas, A.; Nichols, R. J.; Siegele, D. A.; Shales, M.; Collins, S. R.; Lim, B.; Braberg, H.; Yamamoto, N.; Takeuchi, R.; Wanner, B. L.; Mori, H.; Weissman, J. S.; Krogan, N. J.; Gross, C. A. (2008). "High-throughput, quantitative analyses of genetic interactions in E. Coli". Nature Methods. 5 (9): 781–787. doi:10.1038/nmeth.1240. PMC 2700713. PMID 19160513.
  7. ↑Butland, G.; Babu, M.; Díaz-Mejía, J. J.; Bohdana, F.; Phanse, S.; Gold, B.; Yang, W.; Li, J.; Gagarinova, A. G.; Pogoutse, O.; Mori, H.; Wanner, B. L.; Lo, H.; Wasniewski, J.; Christopolous, C.; Ali, M.; Venn, P.; Safavi-Naini, A.; Sourour, N.; Caron, S.; Choi, J. Y.; Laigle, L.; Nazarians-Armavil, A.; Deshpande, A.; Joe, S.; Datsenko, K. A.; Yamamoto, N.; Andrews, B. J.; Boone, C.; Ding, H. (2008). "ESGA: E. Coli synthetic genetic array analysis". Nature Methods. 5 (9): 789–795. doi:10.1038/nmeth.1239. PMID 18677321. S2CID 205418664.
  8. ↑"Saccharomyces Genome Deletion Project".
  9. ↑"Yeast Knockout Strains". Open Biosystems. Archived from the original on November 19, 2011.