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secuenciación de Sanger

La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación de ADN que implica electroforesis y se basa en la incorporación aleatoria de dideoxinucleótidos terminadores de cadena p...

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La secuenciación de Sanger es un método de secuenciación de ADN que implica electroforesis y se basa en la incorporación aleatoria de dideoxinucleótidos terminadores de cadena por la ADN polimerasa durante la replicación de ADN in vitro . Tras ser desarrollada por primera vez por Frederick Sanger y sus colegas en 1977, se convirtió en el método de secuenciación más utilizado durante aproximadamente 40 años. Un instrumento automatizado que utilizaba electroforesis en gel plano y marcadores fluorescentes fue comercializado por primera vez por Applied Biosystems en marzo de 1987. [ 1 ] Posteriormente, los geles planos automatizados fueron reemplazados por la electroforesis en matriz capilar automatizada. [ 2 ]

Recientemente, la secuenciación Sanger de alto volumen ha sido reemplazada por métodos de secuenciación de próxima generación , especialmente para análisis genómicos automatizados a gran escala . Sin embargo, el método Sanger sigue siendo ampliamente utilizado para proyectos de menor escala y para la validación de resultados de secuenciación profunda. Aún presenta la ventaja sobre las tecnologías de secuenciación de lectura corta (como Illumina) de que puede producir lecturas de secuencias de ADN de > 500 nucleótidos y mantiene una tasa de error muy baja con precisiones cercanas al 99,99 %. [ 3 ] La secuenciación Sanger todavía se utiliza activamente en esfuerzos para iniciativas de salud pública, como la secuenciación de la proteína de la espícula del SARS-CoV-2 [ 4 ] así como para la vigilancia de brotes de norovirus a través de la red de vigilancia CaliciNet de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos . [ 5 ]

El método de Sanger (terminación de cadena) para la secuenciación de ADN

Método

Moléculas ddNTP fluorescentes

El método clásico de terminación de cadena requiere una plantilla de ADN monocatenario, un cebador de ADN , una ADN polimerasa , desoxinucleótidos trifosfato normales ( dNTP ) y dideoxinucleótidos trifosfato modificados ( ddNTP ), los cuales terminan la elongación de la cadena de ADN. Estos nucleótidos terminadores de cadena carecen del grupo 3'- OH necesario para la formación de un enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos, lo que provoca que la ADN polimerasa detenga la elongación del ADN cuando se incorpora un ddNTP modificado. Los ddNTP pueden marcarse radiactivamente o con fluorescencia para su detección en secuenciadores automáticos.

La muestra de ADN se multiplica en cuatro reacciones de secuenciación separadas, que contienen los cuatro desoxinucleótidos estándar (dATP, dGTP, dCTP y dTTP) y la ADN polimerasa. A cada reacción se le agrega solo uno de los cuatro dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP), mientras que los otros nucleótidos agregados son los ordinarios. La concentración de desoxinucleótido debe ser aproximadamente 100 veces mayor que la del dideoxinucleótido correspondiente (por ejemplo, 0,5 mM dTTP  : 0,005 mM ddTTP) para permitir que se produzcan suficientes fragmentos mientras se transcribe la secuencia completa (pero la concentración de ddNTP también depende de la longitud de secuencia deseada). [ 6 ] En otras palabras, se necesitan cuatro reacciones separadas en este proceso para probar los cuatro ddNTP. Después de rondas de extensión del ADN molde desde el cebador unido, los fragmentos de ADN resultantes se desnaturalizan por calor y se separan por tamaño usando electroforesis en gel . En la publicación original de 1977, [ 6 ] la formación de bucles de ADN monocatenario con pares de bases causó serias dificultades para resolver las bandas en algunas ubicaciones. Esto se realiza frecuentemente utilizando un gel de poliacrilamida -urea desnaturalizante, con cada una de las cuatro reacciones en uno de los cuatro carriles individuales (carriles A, T, G, C). Las bandas de ADN se pueden visualizar mediante autorradiografía o luz ultravioleta, y la secuencia de ADN se puede leer directamente de la película de rayos X o la imagen del gel.

Parte de un gel de secuenciación marcado radiactivamente

En la imagen de la derecha, se expuso una película de rayos X al gel, y las bandas oscuras corresponden a fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Una banda oscura en una calle indica un fragmento de ADN resultante de la terminación de la cadena tras la incorporación de un dideoxinucleótido (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP). Las posiciones relativas de las diferentes bandas en las cuatro calles, de abajo hacia arriba, se utilizan para leer la secuencia de ADN.

Los fragmentos de ADN se marcan con una etiqueta radiactiva o fluorescente en el cebador (1), en la nueva cadena de ADN con un dNTP marcado o con un ddNTP marcado.

Las variantes técnicas de la secuenciación por terminación de cadena incluyen el marcaje con nucleótidos que contienen fósforo radiactivo para el radiomarcaje , o el uso de un cebador marcado en el extremo 5' con un colorante fluorescente . La secuenciación con cebadores marcados con colorante facilita la lectura en un sistema óptico para análisis lentos y complejos, así como la automatización. El desarrollo posterior por parte de Leroy Hood y colaboradores [ 7 ] [ 8 ] de ddNTPs y cebadores marcados con fluorescencia sentó las bases para la secuenciación de ADN automatizada y de alto rendimiento.

Escalera de secuencias mediante secuenciación radiactiva comparada con picos fluorescentes

Los métodos de terminación de cadena han simplificado enormemente la secuenciación del ADN. Por ejemplo, existen kits comerciales basados ​​en la terminación de cadena que contienen los reactivos necesarios para la secuenciación, prealicuotados y listos para usar. Entre sus limitaciones se incluyen la unión inespecífica del cebador al ADN, que afecta la lectura precisa de la secuencia, y las estructuras secundarias del ADN, que influyen en la fidelidad de la secuencia.

Secuenciación con terminadores de tinte

electroforesis capilar

La secuenciación con terminadores de tinte utiliza el marcaje de los ddNTP terminadores de cadena, lo que permite la secuenciación en una sola reacción en lugar de cuatro reacciones como en el método de cebadores marcados. En la secuenciación con terminadores de tinte, cada uno de los cuatro dideoxinucleótidos terminadores de cadena se marca con colorantes fluorescentes, cada uno de los cuales emite luz en diferentes longitudes de onda .

Debido a su mayor conveniencia y rapidez, la secuenciación con terminadores de tinte es actualmente el método principal en la secuenciación automatizada. Sus limitaciones incluyen efectos de tinte debido a diferencias en la incorporación de los terminadores de cadena marcados con tinte en el fragmento de ADN, lo que resulta en alturas y formas de picos desiguales en el electroferograma de traza de secuencia de ADN electrónico (un tipo de cromatograma ) después de la electroforesis capilar (ver figura de la izquierda).

Este problema se ha abordado mediante el uso de sistemas de enzimas ADN polimerasa modificados y colorantes que minimizan la variabilidad de incorporación, así como métodos para eliminar las "manchas de colorante". El método de secuenciación con terminadores de colorante, junto con analizadores automatizados de secuencias de ADN de alto rendimiento, se utilizó para la gran mayoría de los proyectos de secuenciación hasta la introducción de la secuenciación de nueva generación .

Automatización y preparación de muestras

Vista del inicio de una lectura de ejemplo de terminador de tinte.

Los instrumentos automatizados de secuenciación de ADN ( secuenciadores de ADN ) pueden secuenciar hasta 384 muestras de ADN en un solo lote. Los análisis por lotes pueden realizarse hasta 24 veces al día. Los secuenciadores de ADN separan las hebras por tamaño (o longitud) mediante electroforesis capilar , detectan y registran la fluorescencia de los colorantes y generan datos como cromatogramas de trazas de picos fluorescentes . Las reacciones de secuenciación ( termociclado y marcaje), la limpieza y la resuspensión de las muestras en una solución tampón se realizan por separado, antes de cargar las muestras en el secuenciador. Varios paquetes de software comerciales y no comerciales pueden recortar automáticamente las trazas de ADN de baja calidad. Estos programas evalúan la calidad de cada pico y eliminan los picos de bases de baja calidad (que generalmente se encuentran en los extremos de la secuencia). [ 9 ] La precisión de estos algoritmos es inferior a la del examen visual realizado por un operador humano, pero es adecuada para el procesamiento automatizado de grandes conjuntos de datos de secuencias.

Aplicaciones de la secuenciación con terminación por colorantes

El campo de la salud pública desempeña muchas funciones para apoyar el diagnóstico de pacientes, así como la vigilancia ambiental de sustancias potencialmente tóxicas y patógenos biológicos circulantes. Los laboratorios de salud pública (PHL) y otros laboratorios alrededor del mundo han desempeñado un papel fundamental al proporcionar datos de secuenciación rápida para la vigilancia del virus SARS-CoV-2 , agente causal de la COVID-19, durante la pandemia que fue declarada emergencia de salud pública el 30 de enero de 2020. [ 10 ] Se les encomendó a los laboratorios la rápida implementación de métodos de secuenciación y se les pidió que proporcionaran datos precisos para ayudar en los modelos de toma de decisiones para el desarrollo de políticas para mitigar la propagación del virus. Muchos laboratorios recurrieron a metodologías de secuenciación de próxima generación, mientras que otros apoyaron los esfuerzos con secuenciación de Sanger. Los esfuerzos de secuenciación del SARS-CoV-2 son muchos, mientras que la mayoría de los laboratorios implementaron la secuenciación del genoma completo del virus, otros han optado por secuenciar genes muy específicos del virus, como el gen S, que codifica la información necesaria para producir la proteína de la espícula. La alta tasa de mutación del SARS-CoV-2 genera diferencias genéticas en el gen S, las cuales influyen en la infectividad del virus. [ 11 ] La secuenciación de Sanger del gen S proporciona un método rápido, preciso y económico para obtener el código genético . Los laboratorios en países de bajos ingresos pueden carecer de la capacidad para implementar aplicaciones costosas como la secuenciación de nueva generación, por lo que los métodos de Sanger pueden prevalecer para generar datos de secuenciación para la vigilancia de variantes.

La secuenciación de Sanger es también el método de referencia para la vigilancia del norovirus en la red CaliciNet de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC). CaliciNet es una red de vigilancia de brotes establecida en marzo de 2009. Su objetivo es recopilar datos de secuenciación de los norovirus circulantes en Estados Unidos y activar acciones posteriores para determinar la fuente de infección y mitigar la propagación del virus. La red CaliciNet ha identificado muchas infecciones como enfermedades transmitidas por los alimentos. [ 5 ] Estos datos pueden publicarse y utilizarse para elaborar recomendaciones para futuras acciones que prevengan la contaminación de los alimentos. Los métodos empleados para la detección del norovirus implican la amplificación dirigida de áreas específicas del genoma. Los amplicones se secuencian mediante secuenciación de Sanger con terminación de colorante y los cromatogramas y secuencias generados se analizan con un paquete de software desarrollado en BioNumerics . Se realiza un seguimiento de las secuencias y se estudia la relación entre cepas para inferir su relevancia epidemiológica.

Desafíos

Los problemas comunes de la secuenciación de ADN con el método Sanger incluyen la baja calidad en las primeras 15-40 bases de la secuencia debido a la unión de los cebadores y el deterioro de la calidad de las trazas de secuenciación después de las 700-900 bases. El software de detección de bases, como Phred, suele proporcionar una estimación de la calidad para ayudar a recortar las regiones de baja calidad de las secuencias. [ 12 ] [ 13 ]

En los casos en que se clonan fragmentos de ADN antes de la secuenciación, la secuencia resultante puede contener partes del vector de clonación . Por el contrario, las tecnologías de clonación basadas en PCR y secuenciación de nueva generación basadas en pirosecuenciación suelen evitar el uso de vectores de clonación. Recientemente, se han desarrollado métodos de secuenciación Sanger de un solo paso (amplificación y secuenciación combinadas), como Ampliseq y SeqSharp, que permiten la secuenciación rápida de genes diana sin clonación ni amplificación previa. [ 14 ] [ 15 ]

Los métodos actuales solo permiten secuenciar directamente fragmentos de ADN relativamente cortos (de 300 a 1000 nucleótidos de longitud) en una sola reacción. El principal obstáculo para secuenciar fragmentos de ADN que superen este límite de tamaño es la insuficiente capacidad de separación para resolver fragmentos de ADN grandes que difieren en longitud en tan solo un nucleótido.

Secuenciación Sanger microfluídica

La secuenciación Sanger microfluídica es una aplicación de laboratorio en un chip para la secuenciación de ADN, en la que los pasos de la secuenciación Sanger (ciclo térmico, purificación de la muestra y electroforesis capilar) se integran en un chip del tamaño de una oblea utilizando volúmenes de muestra a escala de nanolitros. Esta tecnología genera lecturas de secuencia largas y precisas, al tiempo que elimina muchas de las deficiencias significativas del método Sanger convencional (por ejemplo, el alto consumo de reactivos costosos, la dependencia de equipos costosos, las manipulaciones que requieren mucho personal, etc.) mediante la integración y automatización de los pasos de la secuenciación Sanger.

En su concepción moderna, la secuenciación genómica de alto rendimiento implica la fragmentación del genoma en pequeños fragmentos monocatenarios, seguida de la amplificación de estos fragmentos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Adoptando el método de Sanger, cada fragmento de ADN se termina irreversiblemente con la incorporación de un nucleótido dideoxi marcado fluorescentemente, produciendo así una "escalera" de ADN de fragmentos que difieren en longitud en una base y llevan una etiqueta fluorescente específica en la base terminal. Las escaleras de bases amplificadas se separan mediante electroforesis capilar en matriz (CAE) con detección automatizada in situ de los fragmentos de ADN monocatenario marcados fluorescentemente, lo que proporciona una secuencia ordenada de los fragmentos. Estas lecturas de secuencia se ensamblan posteriormente por ordenador en secuencias superpuestas o contiguas (denominadas "contigs") que, una vez ensambladas por completo, se asemejan a la secuencia genómica completa. [ 16 ]

Los métodos de Sanger alcanzan longitudes de lectura máximas de aproximadamente 800 pb (normalmente entre 500 y 600 pb con ADN no enriquecido). Las longitudes de lectura más largas de los métodos de Sanger presentan ventajas significativas sobre otros métodos de secuenciación, especialmente en lo que respecta a la secuenciación de regiones repetitivas del genoma. El desafío que suponen los datos de secuenciación de lectura corta radica particularmente en la secuenciación de genomas nuevos (de novo) y en la secuenciación de segmentos genómicos altamente reordenados, como los que se observan en genomas cancerosos o en regiones de cromosomas que presentan variación estructural . [ 17 ]

Aplicaciones de las tecnologías de secuenciación microfluídica

Otras aplicaciones útiles de la secuenciación de ADN incluyen la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), el análisis de heteroduplex de polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP) y el análisis de repeticiones cortas en tándem (STR). La resolución de fragmentos de ADN según las diferencias de tamaño y/o conformación es el paso más crítico en el estudio de estas características del genoma. [ 16 ]

Diseño de dispositivos

El chip de secuenciación tiene una estructura de cuatro capas, compuesta por tres obleas de vidrio de 100 mm de diámetro (sobre las que se microfabrican los elementos del dispositivo) y una membrana de polidimetilsiloxano (PDMS). Entre las dos obleas de vidrio superiores, unidas térmicamente, se graban cámaras de reacción y canales de electroforesis capilar. Las interconexiones de los canales tridimensionales y las microválvulas se forman mediante la membrana de PDMS y la oblea de vidrio inferior.

El dispositivo consta de tres unidades funcionales, cada una correspondiente a los pasos de la secuenciación de Sanger. La unidad de termociclado (TC) es una cámara de reacción de 250 nanolitros con detector de temperatura resistivo integrado, microválvulas y un calentador de superficie. El movimiento del reactivo entre la capa superior de vidrio y la capa inferior de vidrio-PDMS se produce a través de orificios pasantes de 500 μm de diámetro. Tras el termociclado, la mezcla de reacción se purifica en la cámara de captura/purificación y, posteriormente, se inyecta en la cámara de electroforesis capilar (CE). La unidad de CE consta de un capilar de 30 cm plegado en un patrón compacto de curvas en zigzag mediante giros de 65 μm de ancho.

Química de secuenciación

Ciclos térmicos
En la cámara de reacción TC, el reactivo de secuenciación con terminadores de tinte, el ADN molde y los cebadores se cargan en la cámara TC y se someten a ciclos térmicos durante 35 ciclos (a 95  °C durante 12 segundos y a 60  °C durante 55 segundos).
Purificación
La mezcla de reacción cargada (que contiene fragmentos de extensión, ADN molde y exceso de reactivo de secuenciación) se introduce en una cámara de captura/purificación a 30 °C mediante un campo eléctrico  de 33 voltios/cm aplicado entre los puertos de entrada y salida de la cámara. El gel de captura, a través del cual se introduce la muestra, consta de 40 μM de oligonucleótido (complementario a los cebadores) unido covalentemente a una matriz de poliacrilamida. Los fragmentos de extensión se inmovilizan en la matriz del gel, y el exceso de cebador, molde, nucleótidos libres y sales se eluyen a través del puerto de desecho de la cámara. El gel de captura se calienta a 67–75 °C para liberar los fragmentos de extensión. 
electroforesis capilar
Los fragmentos de extensión se inyectan en la cámara de electroforesis capilar, donde se someten a electroforesis a través de un campo de 125-167 V/cm.

Plataformas

La plataforma Apollo 100 (Microchip Biotechnologies Inc., Dublín, California) [ 18 ] integra los dos primeros pasos de la secuenciación de Sanger (ciclo térmico y purificación) en un sistema totalmente automatizado. El fabricante afirma que las muestras están listas para la electroforesis capilar en un plazo de tres horas desde que se cargan la muestra y los reactivos en el sistema. La plataforma Apollo 100 requiere volúmenes de reactivos inferiores a un microlitro.

Comparaciones con otras técnicas de secuenciación

El objetivo final de la secuenciación de alto rendimiento es desarrollar sistemas de bajo costo y extremadamente eficientes para obtener lecturas más largas. Las lecturas más largas de cada separación electroforética reducen sustancialmente el costo asociado con la secuenciación de ADN de novo y la cantidad de plantillas necesarias para secuenciar contigs de ADN con una redundancia determinada. La microfluídica puede permitir un ensamblaje de secuencias más rápido, económico y sencillo . [ 16 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ Chait, Edward; Page, Guy; Hunkapiller, Michael (1988). "Batalla de los secuenciadores de ADN". Nature . 333 (6172): 477– 478. Bibcode : 1988Natur.333..477C . doi : 10.1038/333477a0 . ISSN 0028-0836 . 
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  7. ↑ Smith LM, Sanders JZ, Kaiser RJ, Hughes P, Dodd C, Connell CR, et al. (1986). "Detección de fluorescencia en el análisis automatizado de secuencias de ADN". Nature . 321 (6071): 674– 679. Bibcode : 1986Natur.321..674S . doi : 10.1038/321674a0 . PMID 3713851 . S2CID 27800972 . Hemos desarrollado un método para la automatización parcial del análisis de secuencias de ADN. La detección de fluorescencia de los fragmentos de ADN se logra mediante un fluoróforo unido covalentemente al cebador de oligonucleótido utilizado en el análisis enzimático de secuencias de ADN. Para cada una de las reacciones específicas para las bases A, C, G y T, se utiliza un fluoróforo de diferente color. Las mezclas de reacción se combinan y se someten a electroforesis conjunta en un único tubo de gel de poliacrilamida. Las bandas fluorescentes separadas del ADN se detectan cerca del fondo del tubo y la información de la secuencia se obtiene directamente mediante un ordenador.   
  8. ↑ Smith LM, Fung S, Hunkapiller MW, Hunkapiller TJ, Hood LE (abril de 1985). "Síntesis de oligonucleótidos que contienen un grupo amino alifático en el extremo 5': síntesis de cebadores de ADN fluorescentes para su uso en el análisis de secuencias de ADN" . Nucleic Acids Research . 13 (7): 2399– 2412. doi : 10.1093/nar/13.7.2399 . PMC 341163. PMID 4000959 .  
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Lecturas adicionales

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  • MBI afirma que una nueva herramienta que automatiza la preparación de muestras para el ensayo Sanger reduce los costes de reactivos y mano de obra.
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