Didesoxinucleótido

Los dideoxinucleótidos son inhibidores de la elongación de la cadena de la ADN polimerasa , utilizados en el método de Sanger para la secuenciación del ADN . ^{[ 1 ]} También se les conoce como 2',3' porque tanto la posición 2' como la 3' de la ribosa carecen de grupos hidroxilo , y se abrevian como ddNTPs (ddGTP, ddATP, ddTTP y ddCTP). ^{[ 2 ]}

El método de Sanger se utiliza para amplificar un segmento objetivo de ADN, de modo que se pueda determinar con precisión la secuencia de ADN. La incorporación de ddNTPs en las válvulas de reacción se utiliza simplemente para terminar la síntesis de una cadena de ADN en crecimiento, lo que da como resultado fragmentos de ADN parcialmente replicados. Esto se debe a que la ADN polimerasa requiere el grupo 3' OH de la cadena en crecimiento y el grupo fosfato 5' del dNTP entrante para crear un enlace fosfodiéster . ^{[ 2 ]} A veces, la ADN polimerasa incorporará un ddNTP y la ausencia del grupo 3' OH interrumpirá la reacción de condensación entre el fosfato 5' (después de la escisión del pirofosfato ) del nucleótido entrante con el grupo hidroxilo 3' del nucleótido anterior en la cadena en crecimiento. Esta reacción de condensación normalmente ocurriría con la incorporación de un dNTP no modificado por la ADN polimerasa. En términos sencillos, el ataque nucleofílico del grupo 3' OH conduce a la adición de un nucleótido a una cadena en crecimiento. La ausencia del grupo hidroxilo 3' inhibe este ataque nucleofílico, impidiendo que la ADN polimerasa continúe con su función. ^{[ 2 ]}

Este descubrimiento dio lugar a su nombre apropiado: "nucleótidos terminadores de cadena". ^{[ 2 ]} Los dideoxirribonucleótidos no tienen un grupo hidroxilo en 3', por lo que no puede ocurrir una mayor elongación de la cadena una vez que este dideoxinucleótido se encuentra en la cadena. Esto puede conducir a la terminación de la secuencia de ADN. Así, estas moléculas forman la base del método de terminación de cadena con dideoxinucleótidos para la secuenciación de ADN , que fue descrito por Frederick Sanger y su equipo en 1977 ^{[ 3 ]} como una extensión de trabajos anteriores. ^{[ 4 ]} El enfoque de Sanger fue descrito en 2001 como uno de los dos métodos fundamentales para secuenciar fragmentos de ADN ^{[ 1 ]} (el otro es el método de Maxam - Gilbert ^{[ 5 ]} ), pero el método de Sanger es a la vez "el más utilizado y el método utilizado por la mayoría de los secuenciadores de ADN automatizados". ^{[ 1 ]} Sanger ganó su segundo Premio Nobel de Química en 1980, compartiéndolo con Walter Gilbert ("por sus contribuciones relativas a la determinación de secuencias de bases en ácidos nucleicos") y con Paul Berg ("por sus estudios fundamentales de la bioquímica de los ácidos nucleicos, con especial atención al ADN recombinante "), ^{[ 6 ]} y discutió el uso de dideoxinucleótidos en su discurso de aceptación del Nobel. ^{[ 7 ]}

En un método patentado, se utilizó tetrahidrofurano en un disolvente que contenía 50 g (0,205 mols) de uridina (o, presumiblemente, cualquier nucleósido no protegido ), 112 ml (1,03 mols) de ortoformiato de metilo y 10 g (52,6 mmols) de ácido para -toluenosulfónico a temperatura ambiente con agitación. Después de agitar a temperatura ambiente durante 24 horas, la mezcla de reacción se vertió en una solución acuosa de bicarbonato de sodio seguida de extracción con cloroformo 5 veces. El extracto se secó sobre sulfato de sodio y se concentró para dar 49,5 g (0,173 mols) de 2',3'-o-metoximetilideneuridina (rendimiento, 84,5%). Después de esta reacción, el producto de ejemplo de uridina 2',3'-o-metoximetilideneuridina se disolvió en 50 ml de anhídrido acético a temperatura ambiente con agitación. La solución se calentó a 140  °C. y se mantuvo a esta temperatura durante 5 horas bajo reflujo del solvente. Después de enfriar a temperatura ambiente, el solvente se eliminó por destilación a presión reducida, se agregaron 50 ml de agua y la mezcla se extrajo 3 veces con 100 ml de cloroformo. El extracto se concentró a presión reducida, 30% de agua amoniacal para obtener un rendimiento del 82,3% de 2',3'-dideoxi-2',3'-didehidrouridina. Este ejemplo de producto luego se hidrata para eliminar el doble enlace disolviéndolo en metanol (10 ml) que contiene un catalizador (paladio húmedo al 5% sobre carbono) (400 mg) en una atmósfera de hidrógeno durante 1 h para obtener el dideoxinucleósido resultante (2',3'-dideoxiuridina en este caso). ^{[ 6 ]} El nucleótido colorante que se utilizará probablemente se producirá por tratamiento con una enzima de fosforilación y biotinilación y reacción de la sustancia biotinilada con el colorante. Es posible que también se produzca una reacción inmediata con el colorante, pero se afirma que extender el brazo aumenta la eficiencia en el caso de utilizar una forma mutante de la ADN polimerasa. ^{[ 5 ]}

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