Secuenciación de Maxam-Gilbert

La secuenciación de Maxam-Gilbert es un método de secuenciación de ADN desarrollado por Allan Maxam y Walter Gilbert entre 1976 y 1977. Este método se basa en la modificación química parcial del ADN específica de las nucleobases y la posterior escisión de la cadena principal del ADN en sitios adyacentes a los nucleótidos modificados . ^{[ 1 ]}

La secuenciación de Maxam-Gilbert fue el primer método ampliamente adoptado para la secuenciación de ADN y, junto con el método de dideoxinucleótidos de Sanger , representa la primera generación de métodos de secuenciación de ADN. Actualmente, la secuenciación de Maxam-Gilbert ya no se utiliza de forma generalizada, habiendo sido reemplazada por los métodos de secuenciación de nueva generación .

Aunque Maxam y Gilbert publicaron su método de secuenciación química dos años después de que Frederick Sanger y Alan Coulson publicaran su trabajo sobre secuenciación plus-minus, ^{[ 2 ] [ 3 ]} la secuenciación de Maxam-Gilbert se popularizó rápidamente, ya que se podía usar ADN purificado directamente, mientras que el método inicial de Sanger requería que cada inicio de lectura se clonara para la producción de ADN monocatenario. Sin embargo, con la mejora del método de terminación de cadena (véase más adelante), la secuenciación de Maxam-Gilbert ha caído en desuso debido a su complejidad técnica, que impide su uso en kits estándar de biología molecular, el uso extensivo de productos químicos peligrosos y las dificultades para la ampliación de escala. ^{[ 4 ]}

El artículo de Allan Maxam y Walter Gilbert de 1977, titulado “Un nuevo método para secuenciar ADN”, fue galardonado con una Mención por Avance Químico por la División de Historia de la Química de la Sociedad Química Estadounidense en 2017. El premio fue entregado al Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de Harvard. ^{[ 5 ]}

La secuenciación de Maxam-Gilbert requiere el marcaje radiactivo en un extremo 5′ del fragmento de ADN que se va a secuenciar (típicamente mediante una reacción de quinasa con ATP marcado con gamma- 32P ⁾ y la purificación del ADN. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de una o dos de las cuatro bases nucleotídicas en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Por ejemplo, las purinas (A+G) se despurinan con ácido fórmico , las guaninas (y en cierta medida las adeninas ) se metilan con sulfato de dimetilo y las pirimidinas (C+T) se hidrolizan con hidrazina . La adición de sal ( cloruro de sodio ) a la reacción de hidrazina inhibe la reacción de la timina para la reacción de solo C. Los ADN modificados pueden luego ser escindidos por piperidina caliente ; (CH2 ₎ 5NH _en la posición de la base modificada. La concentración de los agentes modificadores se controla para introducir, en promedio, una modificación por molécula de ADN. De este modo, se genera una serie de fragmentos marcados, desde el extremo radiomarcado hasta el primer sitio de corte en cada molécula.

Los fragmentos de las cuatro reacciones se someten a electroforesis en paralelo en geles de acrilamida desnaturalizantes para su separación por tamaño. Para visualizar los fragmentos, el gel se expone a una película de rayos X para autorradiografía , lo que produce una serie de bandas oscuras que indican la ubicación de moléculas de ADN radiomarcadas idénticas. A partir de la presencia o ausencia de ciertos fragmentos, se puede inferir la secuencia. ^{[ 1 ] [ 6 ]}

Este método dio lugar al ensayo de interferencia de metilación, utilizado para mapear los sitios de unión al ADN de las proteínas de unión al ADN . ^{[ 7 ]}

En 1994 se desarrolló un protocolo automatizado de secuenciación de Maxam-Gilbert. ^{[ 8 ]}

• secuenciación de Sanger